RT-qPCR实验避坑指南

2026-03-17 16:09:38

反转定量

实验技术

避

坑

指

南

为什么我的RT-qPCR总出问题？

Ct值忽高忽低？

同样本不同批次差1–2个Ct？

低表达基因“今天有，明天无”？

和 Western Blot 趋势对不上？

是提取的问题？

是仪器不稳定？

还是操作有误差？

在RT-qPCR的完整流程中：

你怀疑过RNA提取、也复盘过qPCR

而出现结果波动的真正原因

可能恰恰出现在被你忽略的反转录这一步

为什么反转录才是隐藏变量？

qPCR扩增本身相对稳定（可基于MIQE标准推荐公式计算）。真正不可控的是：RNA二级结构/模板丰度差异/反转录酶的稳定性/抑制物残留。

举个栗子，假设反转效率波动较大，Ct值就可能偏移多个循环。而1个Ct ≈ 2倍表达差异。所以选择优质的反转录试剂很重要！

低表达基因为什么总是不稳？

技术误差占比＞生物学差异。当模板拷贝数很低时，任何小的技术偏差都会放大。由于RNA本身容易形成发卡结构、茎环结构，尤其是在高GC区域 UTR区域还有miRNA前体结构等，如果反转录酶打不开复杂结构，就会导致cDNA合成不完全，影响检测。

低表达基因对反应体系中残留的抑制物（如酚、盐离子、多糖、蛋白残留）更敏感，这些抑制物会影响酶活，进而导致后续扩增失败或延迟。

如果模板数极低，甚至接近个位数，由于存在“泊松分布效应”，导致每个反应体系中实际加入的模板数量存在随机波动，技术重复之间的差异变大，当然这属于物理极限问题了。

为什么qPCR上调2倍，WB几乎没变化？

RT-qPCR多数检测的是mRNA，本质为检测基因转录水平。该技术最大的优点：灵敏度高/定量精确/早期变化敏感，但也有相应短板：不能直接反应蛋白水平变化/不反映翻译后修饰。而 WB检测的是蛋白，能直接反映蛋白水平，可检测修饰（磷酸化等）但WB检测属于半定量检测，对于抗体依赖强，重复性相对qPCR差。

为什么两者结果会“对不上”呢？因为蛋白表达调控受到诸多因素的影响，比如：转录后调控/蛋白降解速率不同/miRNA调控/RNA甲基化/蛋白翻译效率改变。需要大家明确mRNA表达量 ≠ 蛋白表达量，两种方法不是互相验证，而是互相补充。

一个好的反转录体系应该具备什么？

当反转录稳定后，你会发现：Ct值更稳定、技术重复更好、生物重复离散度下降、低拷贝模板更易检测。

TIANGEN深耕核酸提取及检测领域超20年，致力于协助分子生物学研究者获得可靠的科研数据，对RT-qPCR的试剂性能持续升级优化，不仅让数据更准确稳定，还让研究者的实验效率大大提升。

3min一步反转录+去基因组

简单快速: 仅需3 min 完成基因组去除及反转录。
高效反转录: 反转获得高质量cDNA，让Ct值更客观，后续定量更精准。
优异模板兼容性: 对动物、植物、细胞、昆虫等及降解样本兼容性高，后续配合荧光定量检测产品，灵敏度高、稳定性好。
cDNA更稳定: 使用高效去基因组DNA的热敏Dnase，效果更佳，cDNA保存更稳定。

快速高效完成荧光定量

快速：新型热启动型Taq 酶，热启时间短，酶活高，让反应更快速。
高效：优化Buffer 体系，保证试剂高扩增效率和产物持异性，扩增曲线起峰早。
仪器广泛适用：不仅适用于快速定量仪器，同样适用于普通定量仪器。

TIANGEN FP237-T1，国外A公司，国内B公司及C公司定量检测结果，分别利用ABI7500仪器检测水稻sui1基因表达（cDNA投入量一次为20/2/0.2/0.02/0.002 ng）。

结果表明，与同类型试剂相比，TIANGEN的FastReal快速荧光定量PCR预混试剂 Ⅱ（FP237-T1） Ct值靠前，线性期长。

核酸污染快速清除剂

应用广泛：用于核酸提取、PCR、qPCR、NGS建库实验等操作环境、台面及设备表面的核酸污染的清除。
快速高效：5 min即可高效清除核酸污染。
腐蚀性低：基本不损伤仪器设备。
操作简单：直接喷洒于物体表面和空气。

开学“剂”限时优惠

众多优惠及好礼不容错过！

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