05_高分辨质谱仪中分子离子的谱图准确度及其在元素组成测定中的意义

2026-03-12 16:51:31, 绿绵科技北京绿绵科技有限公司

原文出自：J Am Soc Mass Spectrom. 2009 Nov;20(11):2058-69.

尽管质谱仪硬件和软件工具都取得了重大进展，但未知物的鉴定和结构解析仍然具有挑战性。虽然高质量准确度和精密度对确定小分子的元素组成非常有价值，但当面对较大质量（＞600 Da）的复杂元素组成时，仅靠高质量准确度（＜1 ppm）无法排除足够多的潜在候选物，难以真正发挥作用。

传统上，可以通过限制可能存在的元素并应用其他化学约束来减少化合物候选物列表，但该列表仍可能轻易包含数十种化合物。然而，高分辨率质谱图还包含由化合物中各种同位素的自然丰度（Natural Abundances）产生的峰强度信息。这种同位素信息可用于排除那些虽然质量匹配良好，但与观察到的同位素模式（Isotope Pattern）不一致的元素组成。长期以来，同位素峰（M、M+1、M+2……）相对强度的简单测量被认为是减少含溴、氯或硫化合物可能元素组成的有力补充指标，因为这些元素具有独特的同位素模式。然而，对于碳、氢、氮和氧产生的细微同位素差异，需要更复杂的计算方法才能有效解析元素组成。

同位素信息利用的三类方法

根据同位素信息的处理方法，现有公开方法可分为三类：

① 利用质谱质心数据（Mass Spectral Centroid Data）：即小分子通常 2 至 5 个主要同位素的有限列表。这类方法包括Grange及其同事的早期研究、通过 MassLynx 软件（沃特世公司）提供的商用工具 iFIT，以及Zweigenbaum的专利方法（利用主要同位素峰的同位素丰度和质量亏损）、Amirav的方法（将同位素丰度与超声分子束或电子电离相结合）。

② 利用轮廓质谱数据（Profile Mass Spectral Data）：不进行质心化，直接利用同位素模式的独特性和理论可预测性（即使单个同位素和同量异位素未被完全分辨）。包括布鲁克道尔顿（Bruker Daltonics）软件中的 SigmaFit 方法、Fernandez-de-Cossio等人的独立方法，但存在峰形函数假设导致的误差。

③ 质谱校准后利用轮廓数据：先进行包括峰形函数在内的质谱校准，再通过矩阵计算方法计算谱图准确度和谱图误差，保留所有同位素精细结构信息，避免质心化和峰形假设的缺陷。这一方法由美国Cerno Bioscience公司提出，被应用在MassWorks软件中，定义为谱图准确度（Spectral Accuracy, SA%）以反应质谱仪能真实测量离子同位素分布的能力。

Orbitrap谱图准确度对化合物分子式的鉴定能力

1. 实验部分

样品信息：万古霉素、环孢素 A、红霉素、利福平、莫昔克丁、雷帕霉素、地高辛、咖啡因、维拉帕米、两性霉素 B 等

储备液制备：根据化合物溶解性分别溶于乙醇、水或 DMSO，稀释后用于质谱分析（正电离模式含 0.1% 甲酸，负电离模式含 0.1% 乙酸）

仪器参数：LTQ-Orbitrap 质谱仪，喷雾电压 1.4-1.85 kV，离子传输管温度 125℃，流速 50-150 nL/min

分辨率设置：7.5、15、30、60、100 K（定义于 m/z 400 处），锁定质量功能（Lock Mass Function）用于实时内标校准

数据处理：Xcalibur 软件采集数据，MassWorks 软件通过sCLIPS 工具计算谱图准确度和谱图误差。

表1：实验化合物信息：所研究质子化或去质子化分子的分子式和精确质量

2. 结果与讨论

分辨率对谱图误差的影响

除少数例外，谱图误差随分辨率的提高而增大：7.5 K 分辨率下谱图误差最小（≤3%），100 K 分辨率下部分化合物（如万古霉素）的谱图误差超过 10%（表 2）。这一现象可能与同位素拍频现象有关，而非库仑相互作用（Orbitrap 扫描时间短于该现象所需时间）。

表2：Orbitrap 不同分辨率设置下的质量误差和谱图误差

图1：在 7.5 K（a）、30 K（b）和 100 K（c）分辨率下所获取的vancomycin的单电荷加和离子的质谱图，展示了随着分辨率的提高，谱图准确度逐渐降低的情况。相比之下，在 7.5 K（d）、30 K（e）和 100 K（f）分辨率下所获取的vancomycin碎片的质谱图，其谱图误差小于 6%。

图2：thiostrepton在 15K（a）和 100 K（b）分辨率下的质谱图。插图展示了低于 100 万计数的离子实验数据所缺失的强度信息，该缺失在 100K时比在 7.5K时更为显著。

图3：针对五种不同分辨率设置，分别绘制了谱图误差与m/z的关系图。

谱图准确度与质量准确度的排名对比

谱图准确度在元素组成排序中表现更优：正确分子式的排名显著高于质量准确度排名，且能排除＞99% 的假阳性候选物（分子量＞900 Da 的化合物）（表 3）。例如，红霉素在所有分辨率下基于谱图误差均排名第一，而基于质量准确度仅排名 16-23 位。

表 3. 基于谱图误差或质量误差的元素组成排名

电荷状态的影响

双电荷离子的谱图准确度表现更优（如硫链丝菌肽的双电荷离子排名第一至第四，而单电荷离子排名第二至第七），可改善高质量（m/z）离子的元素组成测定。

3. 结论

谱图误差随 Orbitrap 质谱仪分辨率的提高而增大，与同位素精细结构和同位素拍频现象相关，与分子量无强烈相关性。
谱图准确度在元素组成排序中显著优于质量准确度，能有效排除假阳性候选物，还可提供离子干扰（如二聚化、氧化）的相关信息。
分子量＞900 Da 的化合物，谱图准确度将正确的元素组成列在了候选分子式中排名前 0.5% 的位置，从而排除了超过 99% 的错误候选物。

关于MassWorks 软件

MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。