42_在Orbitrap上利用精细同位素结构结合高质量准确度和高谱图准确度辅助未知物鉴定

2025-11-20 10:46:52, 绿绵科技北京绿绵科技有限公司

轨道阱质谱仪（Orbitrap）凭借高达100K以上的分辨率和优于3ppm 的高质量准确度，已成为定性质谱分析的重要工具。此类性能虽足以用于小质荷比（<250Da）未知物的分子式测定，或在施加额外约束条件（如限定化学元素及其上下限值）的场景中应用，但对于大多数实际药物杂质的鉴定，仅靠 3 ppm 的质量准确度仍无法实现高置信度识别。

下文介绍一种基于质谱峰形校准的新方法，该方法利用精细同位素结构，可对真实未知物进行可靠且置信度高的分子式鉴定。

Orbitrap上借助谱图准确度辅助鉴定未知物的分子式

1. 数据采集

采用 LTQ / 轨道阱质谱仪（LTQ/Orbitrap），在 100K 分辨率下对表 1 所列 8 种市售化合物的混合物进行液相色谱 - 质谱联用（LC/MS）分析。

表1：基于谱图准确度的药物分子式鉴定总结

2. 数据分析

将轨道阱质谱仪采集的所有质谱数据导入MassWorks 软件中进行处理，进行sCLIPS（自校准线形同位素轮廓搜索）分析。sCLIPS 仅通过峰形校准，以实测单同位素峰作为校准标准，将实际峰形函数转化为已知数学函数。将该校准函数应用于未知离子的完整同位素图谱后，可得到具有相同已知峰形函数的校准同位素图谱，进而用于计算任意给定候选分子式的理论质谱图，实现高谱图准确度（SA）的精确同位素建模。

图1：sCLIPS的原理——sCLIPS 功能仅通过峰形校正，将实际峰形函数转化为已知的数学函数 —— 该过程以测得的单同位素峰本身作为校正标准。当这一功能应用于未知离子的整个同位素丰度分布时，未知离子的同位素丰度分布会被转化为具有相同已知峰形函数的校正后同位素丰度分布，随后该分布将用于计算任意给定候选分子式的理论质谱图，从而实现具有高谱图准确度（SA）的精确同位素模拟。

3. 结果与讨论

3.1 分子式检索条件：

分子式检索在宽松条件下进行，质量误差设为 5 ppm，不饱和度为 -1 至 50，电荷状态选择Even偶电子。元素组成选定 C、H、N、O、S、Cl、F、P，个数其下限设为 0，上限则根据待检索分子的分子量除以对应元素的原子量来确定。例如，在检索m/z = 240 的安非他酮（Bupropion）时，碳的上限为 240 除以 12，即 204。

3.2 谱图准确度的作用：

谱图准确度已被证实在通过峰形校准确定元素组成的过程中，是排除假阳性分子式的有力指标。谱图准确度方法与其他方法的根本区别在于，该方法使用校准后的轮廓质谱图，进行精确的同位素建模，而其他方法要么采用过于简化的棒状（质心）质谱图，要么使用假定峰形函数的轮廓质谱图。先前研究表明，对于一组分子量大于 800 amu、质量误差为 2 ppm 的化合物，基于谱图准确度可排除高达 99% 的错误分子式。针对分子量小于 500 amu 的小分子的研究，也取得了类似结果。

八种化合物在通过峰形校准后的获得了高的谱图准确度，并成功将全部的分子式鉴定为排名第一或第二的结果，具体总结在图2中。所有检索均在非常宽松的条件下进行，涵盖了大多数常见元素，且对其上下限没有任何限制。若没有谱图准确度的辅助，要明确鉴定这些小分子将极具挑战。

图2：谱图准确度鉴定8个化合物的分子式的结果

3.3 泼尼松的鉴定：

以泼尼松（Prednisone）的分子式检索为例，其[M + H]离子的正确分子式 C₂₁H₂₇O₅，在总共 44 个候选分子式中排名第一。图 3 展示了排名前四的分子式及其精细同位素结构，以说明谱图准确度在鉴定真正未知化合物方面的强大作用。真正的泼尼松分子式，含有碳、氢、氧元素，其 A+1 峰主要由 ¹³C 贡献，占比 23.5%；A+2 峰则由 ¹³C¹³C 和 ¹⁸O 贡献，占比 2.9% 。理论计算质谱图（黑色）与校准质谱图（红色）之间，泼尼松具有高度匹配的同位素模式，这从其较高的谱图准确度可以看出。排名第三和第四的分子式均含有氮原子，导致出现两个不匹配的情况，使得谱图准确度远低于排名第一的结果。第一个不匹配源于 A+1 峰，由于分子中碳原子较少；同时，C₁₈H₂₇N₂F₃P 和 C₁₇H₂₃N₄F₄引入了第二个不匹配，因为实际化合物中不存在这样的峰。虽然主要的谱图误差来自 A+1 峰，但 A+2 峰也存在明显差异。

图3：泼尼松的精细同位素结构分析

4. 结论：

1）对于大多数实际药物杂质的鉴定，仅 3ppm 的质量精度，不足以实现高可信度的鉴定。而基于利用同位素精细结构对质谱峰形进行校准，能够可靠地鉴定真正未知物的分子式。

2）谱图准确度为成功鉴定未知化合物的分子式，提供了一种独特且有效的方法。凭借谱图准确度，所有化合物都被正确鉴定为排名第一或第二的结果。

3）高质量准确度与高谱图准确度的结合为未知物分子式鉴定提供了更高效的解决方案。轨道阱质谱仪在 100K 分辨率下获得的精细同位素结构，是实现高置信度鉴定的关键。谱图准确度作为核心指标，可有效排除假阳性结果，显著提升鉴定可靠性。

关于MassWorks 软件

MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。