【干货】表面等离子体共振（SPR）传感图技术解析

在表面等离子体共振(SPR)分子互作实验中，传感图(Sensorgram) 是反映分子结合动力学、亲和力的 “直接语言”—— 它像 “分子互作的心电图”，实时记录芯片表面配体与分析物的结合、解离全过程。掌握传感图的解析逻辑、质量判断与问题排查方法，是避免实验 “走弯路”、获取可靠数据的核心。

本文从基础到进阶，系统梳理SPR传感图关键技术要点，助力实验人员高效开展研究。

完整的SPR传感图一般由4个核心阶段组成，横/纵坐标的物理意义直接关联分子结合量，是解析的基础。

• 横坐标：时间（单位:秒,s），覆盖从基线到解离结束的完整实验时序；

• 纵坐标：响应值（共振单位,RU），反映芯片表面分子结合量

• 单位定义：1 RU ≈ 1 pg/mm²（每平方毫米芯片表面结合1 pg 蛋白质，约产生1 RU信号变化）

实验数据可靠的前提是 “传感图质量达标”，可通过 “看基线、看突变、看曲线、看重复” 快速判断：

1. 稳定基线：缓冲液流动时，基线漂移较小，无高频噪声（排除温度、气泡干扰）；

2. 小折射率跳变（Bulk Shift）：进样/停样瞬间，信号跳跃 <5 RU（说明样品与缓冲液折射率匹配，无非特异性干扰）；

3. 无质量传输限制：结合相为平滑指数曲线，非直线（确保结合由分子互作速率控制，而非扩散限速）；

4. 指数曲线形态：结合相呈指数增长、解离相呈指数衰减，曲线有明显曲率（符合1:1 Langmuir结合模型）；

5. 可达稳态：高浓度分析物注入时，信号能趋于水平状态（用于计算平衡亲和力K_D）；

6. 充分解离：解离时间足够长（通常 180-600 s），信号衰减≥5%（确保解离速率常数k_d计算准确）；

7. 合适响应值：结合最大响应值 Rmax<100 RU（减少分子空间位阻，降低质量传输，降低拟合偏差）；

8. 合理浓度梯度：分析物浓度覆盖 “0.1-10 倍K_D”，曲线在图上均匀分布（无重叠或信号过弱）；

9. 重复可靠：至少 1 个浓度点设 2-3 次重复，重复曲线重叠度高（验证系统稳定性）

一个分子，即分析物(A)，以可逆的方式与一个分子，即配体(B)结合。

• k_a（结合速率常数）：反映分子结合效率（与分子大小、电荷、位阻相关），单位:M⁻¹s⁻¹；

• k_d（解离速率常数）：反映复合物稳定性（与分子间化学键强度相关），单位:s⁻¹；

• K_D（解离平衡常数）：也被称为亲和力，表示平衡状态下一半配体被分析物占据时的分析物浓度，单位:M。数值上，K_D=k_d/k_a，K_D越小，亲和力越强。

  
  

在相互作用开始时，测量配体未接结合时的基线。然后通过引入分析物，形成配体-分析物（AB）配合物。相互作用形成的络合物的量（浓度）可以用微分方程来计算：

• d[AB]/dt：结合净速率；

• B₀：配体初始浓度；

• [AB]：复合物浓度；

• [A]：分析物浓度
  

我们可以使用SPR设备的实时响应信号来替换以上公式：

• dR/dt：响应值随时间的变化率，及结合曲线的瞬时斜率，单位RU/s；

• C₀：分析物的初始浓度，单位:M；

• R：在时间 t 时的响应值，单位:RU;

• R_max：配体所能产生的最大理论响应值，单位:RU

① 结合相（指数增长）：

• R_t：在时间t时刻的响应值；

• R_eq：随着注入分析物浓度的变化所能达到的最大响应（平衡响应）；

• C：分析物浓度

特征：当R远小于平衡响应值R_eq时，即初始阶段信号将快速上升; 随着R接近R_eq，上升逐渐平缓，最终接近水平状态。

在结合与解离达到平衡时，即dR/dt=0，此时可从上方公式得到R_eq与R_max关系：

从传感图得知：

• 当平衡响应值R_eq大约为最大响应值 R_max的一半时，K_D 值等于分析物浓度

•  R_eq/R_max比值与分析物浓度C₀成线性关系

② 解离相（指数衰减）：

• R₀：解离开始时的响应值；

• t₀：解离开始时的时间

特征：区别于结合曲线，解离曲线仅由k_d决定 ——k_d越小（复合物越稳定），曲线越平缓

此外，还可通过半衰期t_1/2=ln(2)/k_d 直观判断稳定性，如k_d=10⁻³s⁻¹时，t_1/2≈693 s ≈12 min，复合物稳定：

③ 典型曲线：

这些曲线在结合率和解离率上有所不同，但其形状都属于指数型。曲线由左至右为相对更快的结合速率及解离速率。然而，不能直接从图形比较结合速率，因为结合速率也取决于分析物浓度（参考前面动力学公式）。

SPR分子互作最常见的1:1 Langmuir Isotherm模型下，结合相和解离相均呈 “单指数曲线”—— 这是判断数据是否符合理想互作的核心依据。

然而，有时候曲线看起来却是线性而非指数型。

这种情况一般是一种叫“质传效应（MTL，Mass-transfer Limited）”的现象限制了动力学。

如上图所示，由于B（Ligand）相固定于芯片表面，A（Analyte）、B两种物质的结合行为并非均相混合。所以在使用模型时，必须要考虑到分子扩散的影响，即质传效应（MTL）。在分析物注入开始后，当分析物与配体的结合速度比分析物向配体的扩散速度快，传感芯片表面就来不及补充，造成分析物短缺。这种形成的原因可能是配体固定密度过高、分子亲和力极强或者缓冲液流速过慢。

• k_a（结合速率常数）：单位M⁻¹s⁻¹，反映分子结合效率（与分子大小、电荷、位阻相关）；

• k_d（解离速率常数）：单位s⁻¹，反映复合物稳定性（与分子间化学键强度相关）；

• k_m（质量传输系数）：单位m·s^-1，与质量迁移与分析物A的扩散系数（D）、流动池经过的体积流速（v）以及流动池的长宽高（h、w、l）相关；

• k_f（正向反应速率）：分子相互作用中分析物从流路体相到芯片表面形成复合物的速率；

• k_r（逆向反应速率）：分子相互作用中复合物从芯片表面解离并回到流路体相的速率；

• K_D（平衡解离常数）：也被称为亲和力，表示平衡状态下一半配体被分析物占据时的分析物浓度。K_D=k_a/k_d（单位 M），K_D越小，亲和力越强。
  

  
  

从以上推导的公式我们可以得到以下结论：

1. k_m越大（扩散越快），k_f和k_r越接近k_a，k_d，越符合模型；

2. ka[B]应远小于km_，所以在ka较大的情况下(结合速率较快)，减小[B] (即R_max) 以确保动力学数据的准确性；

3. km的影响因素包括流动池的尺寸、扩散系数、流速。其中仪器设计决定了流动池的物理尺寸，分析物的分子量大小决定了扩散系数（分子量越小，扩散系数越大）。因此，在确定了实验体系的情况下，可适当提高流速提高km大小

   
   

可靠的动力学分析需要减少质传效应（扩散控制），因此要提高流速（通常为30  μL/min）、降低B物质(即配体Ligand)含量(通常控制饱和载量R_max＜100 RU)等措施。这就代表需要高灵敏度的传感器来捕捉变化，SPR无疑是目前最优的一种技术。

参考极瞳生命历史文章:质传效应 — SPR动力学试验中不可忽略的现象

实验过程中主动观察传感图，建议同时查看实验通道（B）、参比通道（A）、扣减后通道（B-A），可及时发现问题并调整，避免浪费样品与时间：

• 如果异常信号在A和B通道中存在，但在扣除后消失，该异常通常是系统性的（如折射率效应、非特异性结合），数据仍然可信；

• 如果异常信号在扣除后依然存在：该异常是与特异性相互作用相关的，需要高度重视，如双相结合（如下图，存在多种快慢不同的结合情况使其严重偏离指数型拟合曲线）或不完全解离

1. 基线期：看系统稳定性

   信号是否平稳，有无漂移 / 噪声；

   持续漂移→延长平衡时间（如缓冲液冲洗 30-60 min），无效则清洗流路；高频噪声→执行月度维护操作排除气泡和污染，检查电源稳定性

   
   

2. 进样期：看折射率突变

   进样/停样瞬间，信号跳跃大小和形状

   跳跃> 5 RU→下次实验需通过透析 / 稀释使样品与缓冲液匹配；跳跃形状异常（缓慢上升/下降）→排查流路堵塞或气泡

   
   

3. 结合相：看动力学控制类型

   前30-60s曲线形状；

   曲线呈直线→MTL（按上文对策调整）；曲线有 “拐点”（双相结合）→排查样品纯度（如杂质干扰）；信号 “先升后降”（快速隆起再趋于平缓的驼峰）→检查缓冲液去垢剂浓度或存在竞争

   
   

4. 稳态期：看是否达平衡

   信号是否水平；

   持续缓慢上升→延长进样时间，或优化缓冲液（如加 BSA 减少非特异性结合）；始终无法变平→非特异性吸附，重新固定配体（降低密度）

   
   

5. 解离期：看再生需求

   初始下降速度、末期残留信号；

   几乎无下降（曲线水平）→解离慢或不可逆，提前测试再生条件（如低 pH 、高盐）但不破坏配体活性；残留信号高→不完全解离或非特异性吸附，增加再生时间或调整再生试剂（确保不破坏配体活性）

一般发生以下情况可以考虑中止实验：

• 基线呈现出持续性的大幅度飘移现象；

• 信号中出现剧烈且持续的尖锐峰值，该现象或表明存在严重的气泡干扰或污染问题；

• 所有浓度梯度下的结合曲线均未检测到信号，且在已排除浓度过低这一因素的前提下，该情况可能意味着配体已丧失活性；

• 非特异性吸附问题十分严重，导致信号完全偏离真实情况，无法反映实际数据。

漂亮的拟合未必反映真实规律，看似 “丑陋” 的拟合却可能最贴合数据本质和科学，因为拟合的核心是 “让模型匹配数据”，而非 “让数据匹配模型”。

以1:1 Langmuir 模型为首选，按 3 步完成拟合与验证：

确保传感图满足 “基线稳、无 MTL、曲线为单指数”，否则不建议拟合

• 初始设置

  折射率RI = 0

  k_a = 1*10⁵ M^-1s^-1

  k_d = 1*10^-3 s^-1

  物质迁移常数Tc为1E8

  拟合：全局模式

• 优化技巧

  用不同数量级初始值重复拟合（如k_a取4~6次方），若结果收敛，说明参数可靠

• 曲线重合度

  拟合线与实测曲线重叠；重复弯曲；残差较小

• 参数合理性

  k_a在10³~10⁷ M⁻¹s⁻¹范围内

  k_d在10⁻⁵~1 s⁻¹范围内

• 干扰项检查

  RI贡献、漂移参数远小于结合信号
  

• 坐标轴：纵轴标 “响应值（RU）”，横轴标 “时间（s）”，刻度均匀无断轴；

• 曲线：同时展示实测曲线、重复曲线、拟合线，标注分析物浓度（如 62.5 nM、31.3 nM）；

• 图注：包含实验对象、曲线类型、关键参数（k_a、k_d、K_D及误差），参数符号斜体（如k_a、K_D），单位符合 SI 标准。

为确保他人可重复实验，需包含以下内容：

1. 用于分析的仪器型号；

2. 配体和分析物的产品、来源、分子量；

3. 传感芯片类型

4. 偶联条件

5. 配体密度

6. 缓冲液体系

7. 实验温度

8. 分析物浓度

9. 再生条件

10. 结合响应的拟合图

11. 叠加重复性曲线

12. 数据拟合模型

13. 带有标准误差的结合常数
    

The surface plasmon resonance experiments were performed using a Polariton S-CLASS equipped with a research-grade C5 sensor chip. The ligand (60 kDa,>90% pure based on SDS–PAGE) was immobilized using amine-coupling chemistry. The surfaces of all four flow cells were activated for 7 min with a 1:1 mixture of 0.1 M NHS (N-hydroxysuccinimide) and 0.1 M EDC (3-(N,N-dimethylamino) propyl-N-ethylcarbodiimide) at a flow rate of 5 μl/min. The ligand at a concentration of 5 μg/ml in 10 mM sodium acetate, pH 5.0, was immobilized at a density of 200 RU on flow cell 2; flow cell 1 was left blank to serve as a reference surface. All the surfaces were blocked with a 7 min injection of 1 M ethanolamine, pH 8.0. To collect kinetic binding data, the analyte (34 kDa, >95% pure based on SDS–PAGE) in 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% P20, pH 7.4, was injected over the two flow cells at concentrations of 90, 30, 10, 3.3 and 1.1 nM at a flow rate of 60 μl/min and at a temperature of 20°C. The complex was allowed to associate and dissociate for 90 and 300s, respectively. The surfaces were regenerated with a 5 s injection of 10 mM H3PO4. Triplicate injections (in random order) of each sample and a buffer blank were flowed over the two surfaces. Data were collected at a rate of 1 Hz. The data were fit to a simple 1:1 interaction model using the global data analysis option available within Polaris Control & Analysis Software 1.7 software.

The above content is partially based on the information from the following website: https://www.sprpages.nl