Blazar® CHO AOF 病毒检测方法与传统体外检测方法的外源病毒检测能力对照评估——等效性论证（下篇）

续接上篇，我们已从技术、病毒科检测这两部分内容来评价Blazar^® CHO AOF病毒检测方法。在本期干货中，我们将从阳性对照的验证与使用和灵敏度这两方面来为您解析Blazar^® CHO AOF病毒检测方法。

Blazar^® CHO AOF病毒检测方法已根据ICH Q2 指南进行了检测限验证（见参考文献7）。验证采用了一系列与组合中包含的每个病毒科相对应的合成核酸阳性对照（总共27个对照序列）。这代表其验证范围比通常体外检测进行的验证更广泛，后者仅生成少量阳性对照病毒的数据。因此，Blazar^® CHO AOF病毒检测方法可以提供所覆盖的每个病毒科的检测限（表3）。

表3：Blazar^® CHO AOF 病毒检测方法中

包含的病毒科的经验证检测限

每一次符合GMP要求的Blazar^® CHO AOF病毒检测运行都包含内部阳性对照，这些阳性对照在提取核酸之前都加标到（a）PBS和（b）待测样本中，加入量为验证的检测限（10基因组拷贝/反应）。PhiX-174和MS2完整噬菌体（分别代表DNA和RNA基因组）被选为内部对照，用于确认检测的所有阶段（核酸提取、cDNA合成和PCR以及扩增子分离）均受控且可重复。重要的是，它们还在每次检测运行期间提供信息，帮助确定供试品基质是否对DNA和RNA病毒对照检测产生任何干扰。由于这种对检测性能和基质干扰的评估，与实际外源因子检测使用的是同一等分的待测样本，因此这提供了优于体外检测的设计。在体外检测中，加标的供试品等分试样必须作为单独样本运行。

提到污染物检测的替代技术，重要的是要证明该替代技术能够达到与现有检测技术等效的灵敏度。为了生成数据来比较体外检测方法和Blazar^® CHO AOF病毒检测方法的相对灵敏度，我们使用一组活病毒开展了研究。所选择的病毒（无论是市售的，还是来自我们内部病毒学部门的库存）代表了各种基因组构成和物理特性的病毒（表4）。使用微滴式数字PCR测定每种病毒保存液的基因组拷贝（gc）浓度。为了模拟具有代表性的待测样本，本研究使用来自生产人IgG1单克隆抗体的CHO-K1细胞的生物反应器材料（采购自美国马萨诸塞州贝德福德市的默克公司）作为样本基质。

表4：概念验证和等效性研究中使用的病毒的特征

在最初的概念验证研究中，我们向1mL未处理的生物反应器材料中，以不同的半数组织培养感染剂量浓度（TCID₅₀/mL，以便与体外检测方法的经验证检测限进行比较）和绝对基因组浓度（gc/mL，以便与Blazar^® CHO AOF病毒检测方法的经验证检测限进行比较）加标了病毒。生物反应器材料的细胞密度为每毫升1x10⁷个细胞，以代表可能影响检测灵敏度的背景方面的“最坏情况”（在经验证的GMP检测中用于常规检测的生物反应器材料的最大细胞密度为每毫升1x10⁶ 个细胞）。

每个生物反应器样本均双重加标有目标病毒和适当的Blazar^® CHO AOF病毒检测内部对照（phiX-174或MS2噬菌体，最终浓度为每个反应10个基因组拷贝）。表5总结了概念验证研究的结果，表明该检测技术适用于检测复杂CHO收获液基质中的活病毒。

表5：使用Blazar^® CHO AOF 病毒检测方法检测活病毒。即使在高浓度（每毫升 1x10⁷个细胞）的生物反应器材料的情况下，也可以在10 gc/反应（Blazar^® CHO AOF 病毒检测方法的经验证检测限）和 1 TCID₅₀/反应（等于或低于体外检测方法的经验证检测限）检测到病毒

为了证明与体外检测的等效性，以两种检测形式并行检测加标的生物反应器样本。需要指出的是，这两种检测形式在样本初始处理方面有所不同。为了最大限度地观察到任何污染物，Blazar^® CHO AOF病毒检测方法设计为可直接检测收获液样本而无需对其进行进一步加工。相反，对于体外检测，在开始检测之前必须通过低速离心来澄清收获液样本（因为细胞碎片可能会干扰检测细胞系的生长）。

基于历史验证数据和20多年的受监管检测数据，我们能够利用体外检测的先验知识，鉴别可用于检测每种病毒的最敏感细胞系，并确保最大程度检测出加标病毒的可能性。在常规检测中，体外检测的检出率可能更低，具体取决于所使用的检测细胞系。先验知识还使我们能够仅使用单个样本（生成六个技术重复样本）进行体外检测，相比之下，Blazar^® CHO AOF病毒检测方法则对六个独立重复样本（每个具有三个技术重复样本）进行检测以确保可重复性。实验设计示意图如图1所示。

表6总结了研究结果，结果清楚表明两种检测形式在体外检测的经验证检测限（或低于检测限，如SV5的情况）下产生等效结果。因此，实现了本研究的主要目标，即证明Blazar^® CHO AOF检测方法至少能达到与体外检测方法相当的灵敏度。

表 6：当以体外检测方法的经验证检测限进行对照评估时，Blazar^® CHO AOF 病毒检测方法产生与 体外检测方法等效的结果

Blazar^® CHO AOF病毒检测技术可快速检测使用无动物源性成分的工艺产生的CHO细胞收获液材料中的相关外源病毒污染物。在合适的情况下，由于其适宜的病毒检测广度（涵盖病毒变体）和灵敏度，以及表7中概述的一系列优势，我们有充分的理由将其作为传统体外检测的合适替代方法。所生成的数据显示其与体外检测具有等效灵敏度，这符合监管期望，即与现有检测方法相比，任何替代检测方法都必须表现出等效或更优性能。

表 7:传统体外检测方法与 Blazar^® CHO AOF 病毒检测方法的收获液批次放行检测比较

使用Blazar^® CHO AOF病毒检测方法还符合行业和监管趋势，即加强分子学方法的应用，特别是在下游工序中，因为快速获取结果有助于加快决策。它可以与其他快速方法结合使用，能显著缩短收获液批次放行检测包的总检测周期（图2）。在实施任何替代技术之前，都应进行风险评估，并强烈建议与监管机构进行早期对话，以确保满足监管机构对各开发商特定产品和情况的期待。

图 2:通过实施 Blazar^®CHO AOF 病毒检测方法以及无菌检测、支原体检测和逆转录病毒样颗粒(RVLP)定量等其他快速方法,可将 CHO 收获液批次放行检测时间缩短多达三周。通常仅前三批需要进行 RVLP 定量

默克BioReliance®生物安全检测服务团队将持续为中国及全球客户提供优质且专业的检测服务、技术支持和法规咨询。如您有更多的业务需求，请随时通过biosafetycn@merckgroup.com联系中国本地商务团队进行询洽。