探索未至之境 | ZenoTOF 8600 超敏质谱解码生物药研究的深度“未知域”

2025-08-21 15:45:04, SCIEX SCIEX

在生物治疗药物的研发中，关键质量属性（PQAs）的精准检测与表征（如翻译后修饰PTMs、序列变异SVs）直接关系药物的安全性与有效性。与基于碰撞诱导解离（CID）的MS/MS技术相比，电子活化解离（EAD）技术在以下方面具有优势：不稳定性PTMs的准确定位、二硫键解析以及区分氨基酸异构体。当前EAD技术用于常规生物治疗产品表征的挑战在于，如何获得足够的MS/MS碎片信号以实现低丰度PQAs的精细表征。这一挑战在ZenoTOF 8600系统的灵敏度的提升下得以解决，ZenoTOF 8600系统MS和MS/MS灵敏度显著提升，使得结合数据依赖性采集（DDA）方法，低丰度PQAs的常规化深度表征成为可能，为生物药研发质控再添利器！

方案优势

灵敏度突破：

相比上一代高分辨质谱系统，ZenoTOF 8600系统灵敏度提升10倍，在碰撞诱导解离（CID）或电子活化解离（EAD）碎裂DDA模式下，即使极低样本量仍能实现高质量肽图数据。

低丰度PQA检测：

灵敏度提升使得低丰度质量属性（如序列变异SVs、色氨酸氧化产物及其他翻译后修饰PTMs）的检测与鉴定成为可能。

EAD技术独特优势：

电子活化解离（EAD）技术可获得PTMs精确定位，并明确区分氨基酸异构体。

互补分析策略：

CID与EAD技术相互补充，为二硫键定位提供更可靠的数据支持。

分析结果

灵敏度提升助力序列高覆盖

ZenoTOF 8600系统通过对离子源、光学系统和检测器的全面升级，使其MS灵敏度较ZenoTOF 7600系统提升高达10倍，这一突破性进展为生物治疗药物中低含量工艺相关杂质（PQAs）及降解产物高灵敏检测与精准鉴定提供了显著的技术优势。如图1所示，在NIST mAb序列覆盖分析的实验中，当样品量仅为100 ng条件下，ZenoTOF 8600系统即可实现NIST mAb重链（HC）和轻链（LC）94-99%序列覆盖（图1）。而相同条件下， ZenoTOF 7600系统的序列覆盖度低于96%。值得注意的是，在进行CID或EAD碎裂模式的DDA分析，ZenoTOF 8600系统的肽段鉴定数量较ZenoTOF 7600系统提升达2倍。这一优势性能尤其表现在对低丰度翻译后修饰、序列变异体等传统表征难题的解析能力上。

图1. NIST mAb肽图分析结果。

低丰度序列变异体的可靠鉴定和灵敏定量分析

序列变异体（Sequence Variants, SVs）的产生机制主要包括：宿主细胞系的基因突变或翻译错误，生物反应器进料异常或者固有的生物噪声。这类序列变异体的识别和量化极具挑战性，尤其是对低丰度序列变异体的分析。如图2所示，针对NIST mAb中的肽段VVSVLTVLHQDWLNGK及其序列变异体V→Xle （Xle = Ile 或 Leu）的分析表明，在相同进样量条件下，ZenoTOF8600系统相比ZenoTOF 7600系统可实现最高超过6倍以上信噪比（S/N）提升。这一显著的性能改进使得系统能够有效检测到传统技术难以识别的极低丰度（<0.1%）序列变异体，为生物药物质量控制的严格标准提供了强有力的技术支撑。

图2. 肽段VVSVLTVLHQDWLNGK

及其序列变异体提取离子流图。

图3展示了肽段VVSVLTVLHQDWLNGK在V308和V311位点发生取代所产生的两种低丰度序列变异体（SVs）的分析结果，包括提取离子色谱图（XIC）和电子激活解离（EAD）质谱图。尽管这两种序列变异体的含量极低（<0.1%），EAD技术仍能产生丰富的碎片离子，为序列变异体的可靠鉴定可通充分的质谱证据。同时高质量的EAD谱图数据不仅实现对低含量变异体的检测，更成功区分了发生在相邻位点（V308 vs V311）的结构异构体。这一结果充分展现了ZenoTOF 8600系统结合EAD技术在复杂生物药物表征中的独特优势：既能突破传统检测限的束缚，又能提供足够的结构解析力来解决最棘手的序列变异体定位难题。

图3. 肽段VVSVLTVLHQDWLNGK及其两个序列变异体

（V→Xle）XIC图谱和EAD二级图谱。

低丰度翻译后修饰高灵敏度解析及精准鉴别

EAD技术作为一种区别于CID的碎裂模式，在翻译后修饰分析展现独特优势，其通过选择性断裂肽段骨架中α碳-氮键（Cа-N），能够完整保留易发生中性丢失的修饰基团（如糖基化），从而实现对修饰位点的精确定位。如图4所示，针对肽段VVSVLTVLHQDWLNGK及其色氨酸（W）氧化产物的分析表明，即使面对极低含量（<0.01%）且存在同分异构体的复杂体系，ZenoTOF 8600系统结合优化后的肽图分析流程实现卓越的检测性能。该系统不仅成功鉴定了多种色氨酸氧化产物，包括单氧化（Ox）、双氧化（Diox）及色氨酸→犬尿氨酸（W→Kynurenin）转化产物等，更实现了低至0.006%的超微量的色氨酸氧化产物高灵敏检测，其检测性能显著优于前一代平台。此外，如图5所示，EAD即使对这些低丰度氧化产物以及其他的翻译后修饰（如氧化修饰、糖基化修饰和糖化修饰）均能产生丰富的碎片离子，这种全面的碎裂特征不仅保障了修饰肽段的准确鉴定，更重要的是通过特征性诊断离子实现了修饰位点的确认，为生物治疗药物的深度表征建立了新的技术标准。

图4. 肽段VVSVLTVLHQDWLNGK及其

色氨酸氧化产物XIC图谱和EAD二级图谱。

图5. 糖基化修饰和糖化修饰肽段EAD二级图谱。

EAD区分氨基酸同分异构体

EAD技术在氨基酸同分异构体鉴别方面同样具有独特优势，其产生特征性的诊断碎片用于区分氨基酸同分异构体，如天冬氨酸（Asp, D）和异天冬氨酸（isoAsp, isoD），亮氨酸(Leu)与异亮氨酸(Ile)。如图6所示，针对脱酰胺化产物及异天冬氨酸（iso D）修饰的分析中，凭借ZenoTOF 8600系统灵敏度的显著提升，使得低至0.2%-0.4%丰度的同分异构体诊断性碎片检测成为可能（图6）。此外，EAD技术产生诊断性z-57碎片离子确证了肽段中iso D修饰的存在。

图6. EAD技术区分氨基酸同分异构体二级图谱。

EAD联合CID技术表征二硫键

CID 和 EAD 技术各具特色，在肽段鉴定分析形成优势互补。CID技术可提供稳定的 b/y 型碎裂离子，而EAD技术通过独特的碎裂机制产生丰富的碎片离子以及能特异的断裂二硫键，为二硫键连接的肽段鉴定提供可靠的证据。ZenoTOF 8600系统凭借质谱灵敏度提升，使得低丰度二硫键连接肽段能够被灵敏检测和鉴定，显著提高了二硫键定位的可信度。如图7所示，通过对NIST mAb非还原酶切样本中的二硫键连接肽段的分析，EAD产生丰富的碎片离子实现肽段序列高覆盖，同时成功解析传统方法难以鉴定的二硫键连接肽段。这一技术突破为单克隆抗体等生物药物的高级结构确证和质量控制提供了强有力的工具，特别是在二硫键网络解析这一关键质量属性分析方面具有重要应用价值。