天美讲堂丨如何确定荧光寿命？

通过时间相关单光子计数得到激发态分布[M*]。激发态分子浓度[M*]在时间t的衰减为：

其中，[M*]₀是在时间为0时处于激发态分子的浓度。t = 0相当于使用TCSPC时激发脉冲的到达时间。存在多种相互竞争的衰减过程，分别为辐射和非辐射途径。与这些参数相关的速率常数是kr和knr，分别是辐射衰减和非辐射衰减之和的速率常数。用k来表示所有速率常数的总和。

然而，我们不能直接测试激发态分子的浓度。相反，可测试的参数是荧光强度I。在时间t的荧光强度如方程2所示。

其中τ是荧光寿命。τ与速率常数的关系如下：

最简单的荧光衰减为单指数衰减：

其中t是时间，τ是荧光寿命，B是指前因子。荧光寿命定义为强度降至初始值的1/e（=0.368）所需的时间（图1a）。荧光衰减通常以对数坐标显示，对数坐标给出了单指数衰减的线性关系（图1b）。

图1（a）在线性坐标上的的荧光衰减；（b）在对数坐标上的的荧光衰减。¹

拟合方法：

必须用适当的函数对荧光衰减进行拟合。TCSPC数据的拟合有两种常用方法，尾部拟合和解卷积拟合。在多次迭代后，寿命和B指前因子会发生变化，以优化拟合。

拟合评估：

可以通过计算X²来评估拟合。通过原始数据点和拟合点之间的差异，以量化数据拟合的效果。测量的荧光衰减函数N(t_k)和计算的衰减函数N_C(t_k)之间的差值通过数据点的数量n进行评估。

X²值为1表示通过拟合。如果值高于1.2，则表明拟合不能很好地描述此衰减。可接受的X²在不同体系中有所不同，其与噪声相关。在测试样品荧光衰减之前需要确定单组分荧光团，以确定体系可实现的灵敏度。

图2 （a）使用稳态瞬态荧光光谱仪FS5测试的9AA的荧光衰减；（b）Fluoracle^®软件中的单指数拟合分析。

图中τ是通过将单个指数尾部拟合到Fluoracle^®中来确定的。Fluoracle^®软件通过调整τ和B的值，直到获得具有最低残差的最小二乘拟合，即16.2 ns（图2b）。

当样品含有多个荧光团，或单个分子具有多个荧光发射体系（如构象异构体或互变异构体）时，必须使用多指数模型：其中I(t)是作为时间函数t的荧光强度，归一化为t=0时的强度，τ_i是第i个衰变组分的荧光寿命，B_i是该组分的分数振幅。

理论上，模型中可以包含的指数分量的数量没有限制。可以通过增加荧光组分的数量来实现更好的拟合，但要符合样品实际的光物理过程。为了使寿命组分有意义，它们必须代表样品中发生的不同光物理过程，因此应根据预期光物理过程来确定荧光组分的数量。

多指数衰减的一个例子是热激活延迟荧光（TADF）材料。TADF材料荧光衰减为双指数拟合。如图3a所示，可以用两个指数衰减来精确拟合，τ₁=65 ns和τ₂= 1061 ns，其对应材料S1激发态的即时荧光和延迟荧光。

图3 （a） 使用稳态瞬态荧光光谱仪FS5测量的TADF的双指数荧光衰减；（b）Fluoracle^®中的拟合结果。

有许多样品类型不遵循指数衰减行为。无机材料（包括半导体和量子点等体系）的光致发光衰减通常就是这种情况。非指数衰减的一个例子是涂有硫化锌层（InP/ZnS）的磷化铟量子点的光致发光，如图4所示。

图4 (a) 使用稳态瞬态荧光光谱仪FS5测量的InP/ZnS量子点的光致发光衰减；

(b)Fluoracle®中相应的拟合分析，其中突出显示了振幅加权平均寿命（蓝色框）和强度加权平均寿命（橙色框）。

Fluoracle^®软件中显示了两种平均寿命，因为平均寿命有不止一个定义。文献中最常报道的两种平均寿命是振幅加权平均寿命和强度加权平均寿命。需要事先了解材料衰减的内在机制，才能选择应该使用的平均寿命。

振幅平均寿命<τ>_amp，通过其分数振幅（B_i）对每个寿命组分（τ_i）进行加权：⁴

其中：

振幅平均寿命是稳定状态下荧光团的特征，并且在数学上与速率常数相关。³振幅平均寿命通常用于荧光团之间发生能量转移的生物系统中。因此，由于其异质性及其与周围环境的相互作用，其寿命衰减是多指数的。

强度平均值更加强调较长的寿命，降低了分数振幅变化和较短寿命的可见性。这使得平均值在拟合过程中对荧光组分数量的变化显得更加稳定。²强度平均寿命适用于例如发射体系的集合，例如嵌入光子晶体中的量子点，以及荧光依赖于纳米晶体尺寸的半导体纳米晶体。⁵相同材料但不同尺寸的纳米晶体将以不同的波长发射，因此，应考虑纳米晶体的整个激发体系的平均寿命。

拟合最好通过仔细评估体系中的光物理过程来评估，而数学计算的“最优”解并不总是合适的。以与非指数QD系统相同的方式处理单组分稀土样品为例，应该始终根据样品本身特性来决定拟合方法。拟合在很大程度上取决于用户输入的值（拟合范围、背景、建议使用寿命）。拟合结果受这些值的微小变化的影响很大，这些变化将对最终拟合产生无法计算的影响。

本文探讨了拟合单个样品荧光衰减的基本原理。为了提高对体系的理解，可以一起分析多个衰减函数。对荧光衰减的拟合，应始终考虑样品潜在的光物理过程，根据样品本身特性确定拟合方式。爱丁堡一体化稳态瞬态荧光光谱仪FS5可使用Fluoracle®软件对样品进行单指数、多指数或非指数拟合，满足多样化样品拟合需求。

1. D. M. Jameson, Introduction to Fluorescence, 2014.

2. E. Fišerová and M. Kubala, Mean fluorescence lifetime and its error, J Lumin, 2012, 132, 2059–2064.

3. A. Sillen and Y. Engelborghs, The Correct Use of ‘Average’ Fluorescence Parameters, Photochem Photobiol, 1998, 67, 475–486.

4. B. Valeur and M. N. Berberan-Santos, Molecular Fluorescence, Wiley-VCH, 2nd edn., 2012.

5. G. Zatryb and M. M. Klak, On the choice of proper average lifetime formula for an ensemble of emitters showing non-single exponential photoluminescence decay, Journal of Physics Condensed Matter, DOI:10.1088/1361-648X/ab9bcc.