默克病毒安全专家小讲堂 | 二零年药典暗探QbD：除病毒工艺前路向何方？

2023-02-13 10:26:28, 廖逊 Merck工艺解决方案

前言

2020《中国药典》三部生物制品病毒安全性控制中提到，“应明确影响病毒清除效果的关键工艺参数及控制范围，并在此基础上建立充分的产品制备工艺过程的控制策略。” 关键工艺参数（Critical Process Parameter, CPP），控制策略（Control Strategy）等关键词预示着采用QbD理念进行病毒清除工艺开发正在悄然推进。

什么是QbD？

质量源于设计（Quality by Design，QbD）是一套系统的、基于充分的科学知识和质量风险管理的研发方法，从预先确定的目标出发，强调对产品和工艺的理解以及工艺控制^[1]。

简单来说，采用QbD理念进行生物制品的研发和生产，首先会根据生物制品的安全性和有效性明确生物制品的目标产品质量概况（Quality Target Product Profile，QTPP），进而确定生物制品的关键质量属性（Critical Quality Attribute，CQA）。结合工艺流程，通过已有的试验数据和现有的知识进行风险评估，发现与关键质量属性有关联的潜在关键工艺参数。

我们需要对潜在关键工艺参数进行实验设计（Design of Experiments），确定关键工艺参数的可接受范围（Proven Acceptable Range），在保持其它参数不变的前提下，确保在关键工艺参数的范围内的任何运行均可保证产品质量。在结合其他关键工艺参数的可接受范围，建立设计空间（Design Space）和制定工艺过程的控制策略^{[2] [3] [4]}。

QbD如何指导除病毒工艺？

除病毒过滤是生物制品生产工艺中的重要步骤，也是病毒安全策略中的重要组成部分。除病毒过滤技术基于分子排阻原理，可以稳健的去除不同大小尺寸的病毒^{[5] [6] [7]}。

基于QbD理念进行除病毒过滤工艺开发的过程中，先通过风险评估确定潜在的关键工艺参数，再通过试验设计确认关键工艺参数是承上启下的关键环节。

生物制品中的病毒限度是关系到药物安全性的关键质量属性，有效的除病毒过滤步骤对于药物安全性有重要影响，通常我们将单步去除病毒达到4个对数值以上定义为有效的除病毒过滤步骤，凡是可能影响病毒去除对数值的工艺参数定义为潜在的关键工艺参数。例如通过风险评估后，如果过滤压力的波动可能影响除病毒过滤的病毒清除效果，那么过滤压力就是潜在的关键工艺参数。

对于潜在的关键工艺参数，我们需要通过病毒清除的验证试验，考察工艺参数范围内的病毒去除效果。

Viresolve® Pro device助力QbD实施

除病毒过滤工艺开发的核心是考察除病毒过滤器在不同工艺条件下对于病毒的去除效果，对于除病毒过滤器的全面了解在风险评估中至关重要。

默克的Viresolve^® Pro device作为一款基于分子排阻原理的除病毒滤器，广泛应用于生物制品的除病毒过滤工艺中。《Virus Retention Performance of Viresolve^® Pro Devices under a Range of Processing Conditions》这份应用手册归纳总结了Viresolve^® Pro device以往的病毒清除数据，研究了不同工艺条件对于病毒去除效果的影响。

对于已经使用或者即将使用Viresolve^® Pro device的生物制药厂商，这份技术应用手册可以在风险评估的工作中作为先前的知识，应用于风险评估的过程，帮助大家确定除病毒过滤工艺中的潜在的关键工艺参数。

对于除病毒过滤工艺，可以将影响病毒去除效果的工艺参数大致分为三类：料液属性（比如浓度，pH），操作条件（比如过滤载量，过滤压力）和滤器特性（比如批间差异，化学兼容性）。

下表中举例列举了除病毒过滤工艺中，不同的工艺参数和工艺参数范围，以及工艺参数范围波动的原因。接下来的内容中会向大家介绍Viresolve^® Pro device在不同工艺条件下对于病毒的去除情况。

缩小模型的确认

除病毒过滤的工艺开发和工艺验证试验通常采用缩小模型进行测试，法规要求需要确认缩小模型可以代表大规模的生产工艺，小试滤器需要反映大规模生产滤器的性能^[8]。在除病毒过滤工艺开发中，选择合适的缩小模型并且确认其可放大性是至关重要的。

Viresolve^® Pro是一款基于分子排阻原理的除病毒滤器，滤器中采用的是双层不对称聚醚砜材质的滤膜。在相同过滤条件条件下，不同规格的Viresolve^® Pro除病毒过滤器的LRV均能大于4，表明Viresolve^® Pro从小试级别到生产级别的除病毒滤器都具有稳健的病毒清除能力。小试级别的Viresolve^® Pro Micro device除病毒滤器可以准确反映中试级别和生产级别的Viresolve^® Pro除病毒滤器对于病毒的去除能力。

Viresolve^® Pro Micro device除病毒滤器适用于病毒清除过滤缩小模型的研究，可以应用于除病毒过滤的病毒清除验证，来识别除病毒过滤工艺中的关键工艺参数。

物料属性的影响-料液蛋白浓度，

pH，电导率值和温度

对于除病毒过滤的物料属性中，蛋白质浓度的高低会影响除病毒过滤的通量和载量，进而可能影响病毒去除效果。对于蛋白质浓度的影响研究，2-17g/L的四种不同浓度的料液中加入ϕX-174模拟细小病毒，采用Viresolve^® Pro Micro device进行除病毒过滤，过滤后料液中ϕX-174的去除率都可以大于4个对数值，表明2-17g/L的样品浓度范围内，Viresolve^® Pro device可以有效的去除病毒。

pH和电导率值的变化可能会影响病毒在料液中的空间构象，进而导致病毒的分子尺寸发生改变影响病毒去除效果。pH5-7和电导率值7.8-25.4mS/cm的六种料液中加入MVM鼠细小病毒，采用Viresolve^® Pro Micro device进行除病毒过滤。六组试验过滤通量分别衰减75%和90%时，过滤后料液中MVM的去除都可以大于4个对数值，表明样品pH5-7和电导率值7.8-25.4mS/cm范围内，Viresolve^® Pro device可以有效的去除病毒。

除病毒过滤温度的变化可能会造成膜孔的伸缩，进而影响除病毒膜对于病毒的截留效果。采用Viresolve^® Pro Micro device分别在5℃和21℃进行除病毒过滤，过滤后料液中ϕX-174的去除都可以大于4个对数值，表明过滤温度在5℃-21℃，Viresolve^® Pro device都可以有效的去除病毒。但是温度对于滤膜的传质效率有影响，较低的过滤温度会增加料液的粘度从而降低过滤通量和过滤效率。

操作条件的影响过滤载量，

过滤压力和压力中断的影响

对于除病毒过滤的操作条件中，过滤压力的大小会直接影响除病毒过滤的过滤通量和过滤时间。采用Viresolve^® Pro Micro device分别在10-50psi的跨膜压下进行除病毒过滤，过滤后料液中MVM的去除都可以大于4个对数值，表明过滤压力10-50psi的范围，Viresolve^® Pro device都可以有效的去除病毒。适当提高过滤压力可以增加过滤通量和减小过滤时间。过滤终点对应的过滤载量会影响除病毒过滤的过滤时间和滤器的堵塞情况，同时也直接关系到除病毒过滤步骤的生产成本。测试中将Viresolve^® Pro Micro device过滤通量衰减90%作为过滤终点，对应的过滤质量载量达到了13kg/m²，测试不同的过滤质量载量处的过滤后料液，MVM的去除率都可以大于4个对数值，表明过滤质量载量达到13kg/m²的过程时，Viresolve^® Pro device依然可以有效的去除病毒。

生产规模的除病毒过滤过程中会出现有计划的工艺中断和突发状况下的工艺中断，近年来的除病毒过滤验证中都会对压力中断进行试验设计，评估压力中断和压力释放对于病毒清除效果的影响。测试采用单层滤膜和双层滤膜的Viresolve^® Pro Micro device，在样品过滤结束后将过滤压力泄除，中断结束后进行缓冲液冲洗，检测中断后过滤液病毒去除的水平。结果表明双层滤膜的Viresolve^® Pro Micro device在不同中断时长和中断前的过滤压力下，都可以有效的去除病毒，中断前后滤出液中MVM的去除差异小于0.5个对数值。结合以往验证数据表明，部分MVM除病毒过滤验证中，中断后的滤液有检测出细小病毒，但是整体除病毒过滤的LRV还是能满足要求。

考虑到压力中断对于除病毒过滤效果有潜在的影响，在风险评估中需要结合除病毒过滤工艺着重评估压力中断时长，压力中断次数以及中断前过滤压力等工艺参数对于病毒去除的影响。

滤器特性的影响-滤膜批间差异和滤器CIP

在实际生产中会使用不同批次的除病毒滤器，滤器间的批间差异是否会影响病毒去除的效果，也是工艺开发中需要关注的因素。采用不同批次的Viresolve^® Pro 的滤膜，分别考察过滤通量衰减75%，90%和工艺中断后滤膜的病毒清除能力。结果表明在相同的通量衰减和压力中断下，不同批次滤膜都可以有效的去除病毒。

除病毒过滤是非无菌的工艺步骤，对于除病毒过滤系统和滤器的生物负荷的控制非常重要。Viresolve^® Pro device可以耐受0.5M NaOH溶液的预处理来降低生物负荷。采用不同规格的Viresolve^® Pro device滤器，考察经0.5M NaOH溶液处理后不同规格滤器对于ϕX-174去除能力的变化。结果表明不同规格的Viresolve^® Pro device滤器经过0.5M NaOH溶液处理后，对于ϕX-174都可以有效的去除，都能稳定大于4个对数值。

Viresolve^® Pro device，值得信赖的病毒安全专家！

《Virus Retention Performance of Viresolve^® Pro Devices under a Range of Processing Conditions》这份应用手册还包括对以往498次除病毒验证数据进行荟萃分析的结果，表明Viresolve^®Pro device这款除病毒滤器在蛋白浓度0-42g/L，pH4.5-8.5，电导率值1-75mS/cm，过滤压力10-50psi的工艺条件下，基本都能有效的去除病毒。对于已经使用或者即将使用Viresolve^® Pro device的生物制药厂商，这份技术应用手册可以在风险评估的工作中作为参考资料，在应用于风险评估的过程，帮助大家识别除病毒过滤工艺中的潜在的关键工艺参数，合理的设计病毒清除的验证试验，考察工艺参数范围内的病毒去除效果，进而建立合理的设计空间和制定有效的控制策略。

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参考文献：

1. International Conference on Harmonization, ICH Topic Q8 (R2), Pharmaceutical Development, Aug. 2009.

2. CMC Biotech Working Group. (2009, Oct). A-mAb: a Case Study in Bioprocess Development., Ver. 2.1, available from FDA or ISPE.

3. Finkler, C., & Krummen, L. (2016) Introduction to the application of QbD principles for the development of monoclonal antibodies. Biologicals, 44, 282-290.

4. Rathore, A.S., & Mhatre, R. (2009) Quality by Design for Biopharmaceuticals, Wiley & Sons, Hoboken, NJ.

5. Brough, H., Antoniou, C., Carter, J., Jakubik, J., Xu, Y., & Lutz, H. (2002). Performance of a Novel Viresolve® NFR Filter. Biotechnol. Prog., 18, 782-795.

6. DiLeo, A.J., Vacante, D.A., & Deane, E.F. (1993). Size Exclusion Removal of Model Mammalian Viruses Using a Unique Membrane System, Part I: Membrane Qualification. Biologicals, 21, 275-286.

7. Hirasaki, T., Nakano, H., Ishizaki, Y., Manabe, S., & Yamamoto, N. (1994) Mechanism of Removing Japanese Encephalitis Virus (Lev) and Gold Particles using Cuprammonium Regenerated Hollow Fiber (I-BMM Or BMM) from Aqueous Solution Containing Protein. Poly. J. 2, 1244-1256.

8. International Conference on Harmonization, ICH Topic Q5A (R1), Quality of Biotechnological Products: Viral Safety Evaluation of Biotechnology Products Derived from Cell Lines of Human or Animal Origin, Oct. 1997.

关于默克工艺解决方案

默克工艺解决方案是默克生命科学三大事业部之一，致力于为生物制药、化学制药企业提供产品开发、商业化生产所需全系列工具，已成为预过滤、无菌过滤、除病毒过滤、超滤、层析纯化、一次性生产、培养基、生物反应器、缓冲液、药用原辅料、工程技术及验证领域的全球领导者。默克工艺解决方案的成功源于对高质量产品、先进监管技术的不懈追求以及致力于帮助客户实现其需求的精神。

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