肿瘤研究这些必须了解的知识你都get了吗？（二）

继之前小编和大家分享过关于肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌这五大肿瘤的介绍后，根据老师和同学们的反馈，最近小编将其他几个癌种：卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、食管癌、骨肉瘤、胶质瘤也做了归纳和整理，内容主要包括基础临床科研中常用的工具（细胞）、技术手段（动物模型）以及常见基因的突变，欢迎大家多多转发和交流~

食管癌（esophageal cancer,EC）是消化道常见的恶性肿瘤之一，起源于食管上皮或腺体，发病率、死亡率分别居全球第十、第六位，好发于男性（70%），在男性所有肿瘤中食管癌发病率排第六位。按照病理类型，食管癌分为食管腺癌（esophageal adenocarcinoma, EAC）和食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）两种，我国主要为食管鳞状细胞癌。目前，食管癌的发病机制尚不清楚，对食管癌的治疗手段非常有限，患者预后较差，5年生存率较低。因此研究食管癌的发病机制，并寻找有效的早期诊断和治疗方法，是目前食管癌研究的关键。

1. 异种移植瘤模型

CDX异种移植模型：即人源肿瘤细胞系异种移植（cell derived xenograft,CDX）,裸鼠或重度联合免疫缺陷小鼠均可，比较常用的是皮下移植;

PDX模型：即人源肿瘤异种移植模型（Patient-Derived tumor Xenograft，PDX）:将病人的肿瘤组织直接移植到免疫缺陷鼠而建立的人源异种移植模型。

2. 化学致癌模型

亚硝胺致癌模型：甲基苄基亚硝胺（NMBA）、对甲基戊基亚硝胺（MNAN）均可诱发大鼠食管癌；

 4-NQO：一种水溶性喹啉衍生物，诱发小鼠食管鳞癌且致癌率高。

3. 基因工程模型

主要涉及基因cyclinD1、 p53等，如Cyclin D1转基因鼠、p53基因工程鼠。

1. TP53是突变频率最高的抑癌基因，主要分布在第5-8号外显子中，突变频率为17-84%，突变形式为颠换、转换和移码突变。TP53突变位于p53蛋白与DNA结合区域，导致下游基因无法转录，突变型p53还会使p53正常功能丢失，促进肿瘤的发生。

2. CDKN2A即p16基因,在ESCC中突变频率为12%-25%，突变类型主要为基因缺失、基因插入和点突变。CDKN2A基因突变而失活使得细胞生长失去控制，导致肿瘤发生。

3. NOTCH1：是ESCC中突变频率最高的原癌基因，突变频率为8%-21%，以非同义替换为主，大部分的突变可影响表皮生长因子EGF样配基结合区域，导致该区域功能丢失。

4. KRAS：常见突变位点为G13D。

5. PIK3CA：常见突变是E542K和E545K。

6. FBXW7：常见突变是R465C和R505L。

7. Cyclin D1（CCND1）：ESCC中CCND1的突变形式以扩增为主，扩增频率为45%，其异常扩增与肿瘤的淋巴结转移相关，患者生存期较短且治疗后易复发。

骨肉瘤（osteosarcoma， OS）是骨骼最常见的原发性恶性肿瘤，全世界发病率约为3人/100万，好发于儿童与青少年。由于骨肉瘤的恶性程度高、预后差，同时易复发和转移，转移患者5年生存率只有20%。骨肉瘤的发病机制目前尚不完全清楚，目前临床采用手术治疗为主，放化疗和生物治疗为辅的综合治疗，但大多数治疗效果不佳。因此，弄清骨肉瘤的发病机制，探索新的治疗方法及策略势在必行。

1. 自发性骨肉瘤动物模型

NOD-SCID小鼠可自发骨肉瘤，但转移率低

BALA/c小鼠自发骨肉瘤，是良好源性骨肉瘤细胞瘤源

2. 诱发性骨肉瘤动物模型

物理因素诱导：如电离辐射诱导直接穿透组织、细胞；放射性核素如233铀、224镭、238钚、351镅、60钴等核素与动物接触，都可以诱发骨肉瘤；

化学因素诱导：致癌性化学物质，如甲基苄基亚硝胺、甲基硝基亚硝基胍、二甲基胆蒽等注射于动物肌肉；

生物因素诱导：肿瘤病毒如猿空泡病毒40（SV40）、Moloney肉瘤病毒、FBJ、RFB和FBR骨肉瘤病毒及Poluma病毒等诱导骨肉瘤发生。

3. 移植性骨肉瘤动物模型

异位移植模型：应用最为广泛的是裸鼠皮下成瘤模型以及裸鼠尾静脉成瘤模型。

原位移植模型：如将UMR-106骨肉瘤细胞悬液注射于裸鼠胫骨或UMR-106骨肉瘤细胞完整组织瘤块原位移植于裸鼠胫骨；人源性KRIB细胞原位移植的骨肉瘤模型是第一个原位移植成功的模型，并自行发生肺转。

备注：移植常用的鼠源细胞系有：K7M2、K12、UMR-106、Dunn和LM8；人源性细胞株有：POS-1、Hu09、TE-85、U2-OS、SAOS-2等。

4. 转基因骨肉瘤小鼠

主要涉及基因p53、Rb等转基因小鼠。

1. P53可激活促凋亡基因BAX和P21基因，发挥抑制肿瘤的作用，一旦P53失常，会导致体细胞分裂失控，失去保护正常细胞的功能，推动癌症进展。

2. Rb集合转录因子E2F，调节细胞周期，Rb最常见的突变是在13q处出现杂合性缺失（LOH），被认为是食管癌患者预后不良的因素。

3. MDM2为p53结合蛋白，在骨肉瘤组织中出现扩增异常，见于转移和复发肿瘤中。

4. c-Myc突变频率约为10%，且该基因的表达和骨肉瘤的不良预后相关。

5. p16在骨肉瘤细胞系中缺失率达60%，是直接作用于细胞周期的抑癌因子。

此外，骨肉瘤中还发现了PIK3CA、AKT1、FBXW7、RECQL4、BLM（RECQL2）、WRN(RECQL3)等基因突变的类型。

胶质瘤是一种来源于神经胶质细胞的中枢神经系统肿瘤，约占所有中枢神经系统肿瘤的27%，占颅脑恶性肿瘤的80%，是目前最为常见的成人原发性颅内恶性肿瘤。因为胶质瘤生长迅速、侵袭性强、手术后容易复发、病死率高，虽然手术治疗、放疗和药物治疗均有一定的治愈率，但无法完全治愈，预后为12-15个月，5年生存率只有3-5%。因此明确肿瘤细胞的发生和复发机制，以及对抗肿瘤治疗方法的探究，对于治疗胶质瘤至关重要。

1. 诱发模型

化学诱发模型：亚硝基脲及其衍生物，缺点是诱发瘤的种类不一，性质不稳定。

病毒诱发模型：多为逆转录病毒，较常用的病毒有肾病综合征、出血热病毒HFRSV、腺病毒NIH等，缺点是诱发的肿瘤病理性质不稳定，且病毒对人体有害。

2.  移植模型

CDX 异种移植：将体外传代培养的肿瘤细胞接种至免疫缺陷小鼠，常用人胶质瘤细胞系U87 MG、U251 MG、U373、SHG-44；接种部位常为裸鼠皮下，静脉或原位。

CDX 同种移植：常用动物细胞系大鼠C6、9L和小鼠GL261。

PDX 模型（人源肿瘤组织来源移植瘤模型）：通过将病人新鲜的瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的肿瘤模型，常见接种方式为原位皮下接种。

3. 转基因小鼠动物模型

该模型是将外源性基因导入人受精卵雄原核或早期胚胎中，使之与小鼠染色体稳定融合并传递给后一代小鼠。主要涉及基因p53、Rb、EGFR等相关转基因小鼠。

1. IDH突变：研究显示80%以上的WHO II级和III级胶质瘤以及几乎所有的继发GBM均显示IDH突变。人类胶质瘤中主要是IDH1（R132H最常见，约占IDH突变的80-90%）和IDH2（R172K最常见，约占3%）突变，IDH1和IDH2的突变同时发生较少。

2. TERT突变：主要集中在启动子区的C228T和C250T两个位点，总突变率在50%左右，在原发性胶质母细胞瘤中，TERT突变可达70-80%。

3. PTEN突变：使细胞停止分裂进入凋亡。

4. TP53突变：诱导癌细胞自杀、防止癌变，基因修复缺陷。

5. EGFR突变：包括EGFRVIII表达、EGFR- l816q错义突变21外显子和EGFR融合(FGFR3-TACC3)，EGFRVIII是最常见的突变体。

6. BRAF点突变：针对BRAF V600E突变，激活MAPK信号转导通路。

此外，研究还发现了PIK3CA, PIK3R1, PDGFRA, RB1, NF1, RET, STAG2, GABRA6, MSH2, MSH6, MLH1, PMS2等突变。

卵巢癌（Ovarian cancer）是女性生殖系统第三大恶性肿瘤，卵巢癌全球死亡人数达20.7万，死亡率低于宫颈癌。卵巢癌的早期诊断较难，五年生存率仅为20%左右。按组织学分为：上皮来源、生殖细胞来源、特异性索间质来源及转移性卵巢癌，其中上皮性肿瘤占50%~70%，好发于女性绝经之后。卵巢癌发病原因尚不明确，流行病学调查发现卵巢癌可能与持续排卵、环境、遗传等因素有关。

1. 卵巢癌移植瘤小鼠模型（肿瘤原代接种）：将人的2mm×2mm×3mm肿瘤组织，酒精消毒裸鼠背部皮肤后，用穿刺针将瘤块接种至皮下（原代接种），4个点/只，即左、右前肢肩胛骨皮下脂肪塾垫处和与之对应的左、右靠臀部皮下处。

2. 卵巢癌移植瘤小鼠模型（肿瘤传代接种）：操作过程与肿瘤原代接种方法相同，即将切取的第一代瘤组织接种至裸鼠皮下，接种后当移植瘤长至合适大小后进行再次传代，方法同第一代。

3. 人卵巢癌异体移植裸鼠及SCID鼠模型（肾包膜移植模型）：将患者肿瘤标本切成小于２～３mm³的小块，植入6-8周龄的NOD/SCID小鼠左肾包膜下，制成原代肿瘤组织的肿瘤移植模型（PDX模型)。如检测到移植的肿瘤生长即表明模型制备成功。

该模型在15天内体积能够大约增加2倍，成功植入率可达95％，其组织病理学特征与移植后相比呈高度相似；移植后30-60天内所检测的免疫表型能够保持（91±5）％的一致性。该模型具有原发肿瘤的遗传特性和异质性，可以用于肿瘤治疗药物的筛选。

4. CDX异种移植模型：裸鼠或重度联合免疫缺陷小鼠均可，比较常用的是肿瘤细胞系皮下移植、尾静脉注射成瘤模型。

卵巢癌突变包括TP53（49%）、FOXL2（26%）、KRAS（13%）、PIK3CA（12%）、BRAF（7%）、CDKN2A、BRCA1、BRCA2（5%）、NF1、RB1、PTEN等突变。

前列腺癌（Prostate cancer）是中老年男性泌尿系统常见的恶性肿瘤之一。2020年全世界估计有将近140万新发病例和37.5万死亡病例，前列腺癌成为男性中第二大常见癌症和第五大癌症死因。在我国前列腺癌的发病率呈持续上升趋势，不同前列腺癌患者的预后差异较大，部分患者可存活10年之久，但侵袭性前列腺癌患者的存活期一般只有2-3年[1]。根据细胞类型和起源分为前列腺癌和移行上皮细胞癌（如鳞癌、导管腺癌、黏液腺癌、小细胞癌等），其中前列腺癌占前列腺肿瘤的95%以上。吸烟、体重过重和激素可能增加罹患晚期前列腺癌的风险，激素疗法是目前前列腺癌最有效的治疗手段。

1. 自发性犬类前列腺癌模型：该模型易发生、易转移和晚期易发生激素非依赖性转化且有癌灶向骨盆及脊柱进行骨转移的优点；但该模型发生耗时较长，花费较大。

2. 诱发性肿瘤模型：常用的化学诱导剂有 DMAB（3,2''-二甲基4-氨基联苯）、MNU（氮甲基亚硝基尿素）。

激素类诱导剂包括雄激素联合雌二醇诱导和睾酮联合β雌二醇。该模型诱发率高，且与人前列腺癌有很多相似生物学特点，是相对较理想模型。

3.基因修饰模型：TGAMP小鼠前列腺模型，是目前最常用的转基因前列腺癌模型之一，一般到第八周几乎所有前列腺叶出现前列腺上皮内瘤变，到16周左右出现高分化癌，到36周几乎所有TRAMP小鼠出现转移癌。

4. 移植型肿瘤模型 ：裸鼠皮下种瘤；裸鼠原位种瘤；裸鼠尾静脉注射成瘤模型。

包括BRCA1、BRCA2、ATM、CHEK2、 FOXA1、ZNF292、CHD1、HOXB13、MSH2、MLH1、HPC1缺失等突变类型。41%的肿瘤含有FOXA1突变，18%的肿瘤含有ZNF292和CHD1缺失1。

甲状腺癌（Thyroid cancer）是内分泌系统常见的恶性肿瘤，好发于女性，是女性第五大常见癌症。2020年世界卫生组织的统计结果显示：全球甲状腺癌的新发病例为58.6万例，且发病率仍在持续上升，我国的发病率以每年20%的速率增长。甲状腺癌患者的预后较好，五年生存率达到84.3%。临床上甲状腺癌可分为乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌与髓样癌四种病理类型。

1.移植瘤小鼠模型：

裸鼠皮下接种：3×10⁶ TPC-1细胞注射到4-6周龄BALB/c裸鼠皮下,1周可见瘤体，4周左右可成瘤；

裸鼠原位接种：2 x 10⁶ FTC-133接种于裸鼠甲状腺右叶，4周左右可成瘤 ；

尾静脉转移模型：7.5 x 10⁵ 8505C尾静脉注射NOD小鼠，3-4周可致甲状腺癌肺转移瘤；

2. 基因编辑小鼠模型：

此模型为自发型肿瘤小鼠模型。

在甲状腺癌基因工程小鼠模型中，一些基因改变（包括RET/PTC重排和BRAFV600E突变），已被证明是致癌的。已证实MAPK信号通路在PTC中的相关性，RAS突变参与了PTC和FTCs的发展。过度激活PI3K/AKT/mTOR信号通路的小鼠会发生FTCs。这些模型促进科研工作者对甲状腺癌发病机制的深入了解。

甲状腺癌最常见的是BRAF（43%）、RET（20%）、TP53（11%）、NRAS（8%）和HRAS（4%）的改变;；BRAF突变、BRAF 15外显子突变、BRAF 600密码子错义突变、BRAF V600E和NRAS突变是甲状腺癌中最常见的突变类型。

知道了这些肿瘤研究中的细胞、动物模型后，可以开展的研发热点有哪些呢？最近小编有幸参加了2021年4月于重庆的一年一度中国细胞生物学学会，聆听了各位学术大拿的精彩汇报，总结了对于肿瘤研究的热点方向：血管新生、肿瘤干细胞与微环境、肿瘤免疫与抑制、表观遗传和修饰、外泌体、非编码RNA等，下期小编将对这些热点领域做进一步的解析。