蔡司光学课 | 共聚焦显微镜多维成像如何设置不同的扫描策略技巧？

激光共聚焦显微镜作为生命科学实验最常用的仪器之一，几乎会出现在每个生命科学研究者的“ Materials and Methods ”中。蔡司激光共聚焦显微镜 LSM 7/8/9 系列以其高质量的成像结果深受生命科学科研工作者的喜爱，成为了蔡司的“明星产品”。

随着科研手段的不断升级，激光共聚焦显微镜也在不断满足我们越来越多的多维成像需求。但是，我们在实际操作时，难免会因为样品 “罢工”，遇到一些抓狂时刻：

• 三维重构时发现关键层缺失

• 大图拼接有拼缝/阴影

• 时间序列拍摄时发现荧光信号越来越弱

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▲ 鼠脑中的锥体细胞和小胶质细胞——Z轴成像（YFP-H：锥体神经元/CxCR3-GFP小胶质细胞）

Courtesy of Severin Filser, DZNE Bonn, Germany

① 选择Z轴扫描的范围。软件中提供了 First/Last 和Center 两种不同的设定模式。其中，First/Last，可以更直观的确定样品的上/下表面，保证拍摄范围的完整性；Center 模式，将感兴趣的信号设置在 Z 轴的中心。两种设定模式可以根据实际需求灵活选择

② Z轴步进。如果对重构结果Z轴视角有更高的精度需求，我们可以点击 Optimal 使用系统推荐步进，获得更好的重构效果；如需减少漂白/加快速度，我们也可在Interval 输入合适的数值；当我们设置的 Interval＞Optimal 的 2 倍，则有可能出现上述提到的关键层缺失问题

③ 亮度矫正。对于一些比较厚的样品，拍摄时可能发生拍得越深亮度越暗的现象，这时可以使用 Auto Z Brightness Correction，对于物镜远端的样品给予更高的laser power 和Master Gain

④ 速度优化。对于多色样品三维重构，使用 Full Z-stack per Track 采集顺序，可提高整体采集速度哦

⑤ 拍摄结果。软件左侧工具栏，3D 功能可以查看或导出渲染结果；Ortho 则可以获取最大强度投影

▲ 鼠脑切片——10X物镜拼图（绿：神经元/品红：细胞核）

Sample courtesy of Prof. Jochen Herms, LMU München, Germany

① 对于焦面不一致的图像拼接，可调用 Focus Surface and Support Point 功能

② 拼缝是拼图中的正常现象，我们拼图设置会默认tile之间存在 10% 的 overlap。拼图后，使用 Stitching 功能，软件会帮我们一键消除拼缝

③ 如果拍摄结果出现规律的阴影，可使用软件的阴影矫正功能。（先 Shading reference for processing 提取阴影，后在 Stitching 中进行 Correct Shading，并在 Reference 中勾选上一步提取的 Shading 文件）

▲ 细胞内运动的囊泡——时间序列拍摄

Sample courtesy of Daniel Hartmann

① 设置拍摄时长。根据实验需要输入合适的循环数，或总体拍摄时间

② 设置合适的间隔时间。即 Interval（间隔时间包含拍照的时间）

③ 选择对焦策略。在 Focus Strategy 中选择 Software Autofocus / Definite Focus

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