基础实验最伤人？NO，NO，NO，找对方法，稳住心绪，实验 So easy！临近年关的实验收尾阶段，小 M 特奉上 CCK8 详细教程，一起来看下？

Cell Counting Kit-8，简称 CCK-8 试剂盒，是一种基于 WST-8 而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测试剂盒。

CCK-8 溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分。WST-8 在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的 formazan (图 1)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅 (生成的 formazan 量) 和细胞数目呈线性关系 (图 2)。

图 1. WST-8 和 WST-8 formazan 的结构式。

图 2. CCK-8 的原理图。

WST-8 是 MTT 的一种升级替代产品，和 MTT 或其它 MTT 类似产品，如 XTT、MTS 等相比有明显的优点：

WST-8 对细胞无明显毒性。加入 CCK-8 溶液显色后，可以在不同时间反复用酶标仪读板，检测时间更加灵活，便于确定最佳测定时间。

MCE CCK8 试剂盒 (HY-K0301) 可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。

下面就以 HY-K0301 为例，一起来了解下 CCK8 再实验中的具体操作！

图 3. CCK8 实验流程图。

▐  1. 制作标准曲线

(1) 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；

(2) 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 5-7 个细胞浓度梯度，每组 4-6 个复孔；

(3) 接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后每 100 μL 培养基加 10 μL CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD 值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。

注：使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致。

▐  2. 细胞活性检测

(1) 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔)，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；

(2) 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡)；

(3) 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；

(4) 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

▐  3. 细胞增殖-毒性检测

(1) 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔)，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；

(2) 向培养板加入不同浓度的待测药物；

(3) 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；

(4) 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡)；

(5) 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；

(6) 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

▐  4. 计算公式

细胞存活率 = [(As-Ab) / (Ac-Ab)] x 100%

抑制率 = [(Ac-As) / (Ac-Ab)] x 100%

As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液)；

Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物)；

Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物)。

当然，小伙伴们也可查看下方相关 CCK8 操作视频喔~

注：如果待测药物有氧化性或还原性，可在加入 CCK-8 之前更换新鲜培养基，去掉待测药物的影响。当待测药物影响比较小的情况下可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入待测药物后的空白吸收即可。

本次我们根据 MCE 客户的发表文献：RNA interference-mediated depletion of TRPM8 enhances the efficacy of epirubicin chemotherapy in prostate cancer LNCaP and PC3 cells，来看下CCK8 的基础应用实操！

▐  实验组别

① siTRPM8：转染 siTRPM8 的细胞

② siCON：转染 siCON 的细胞 (空转)

③ Parental：未转染的细胞称为亲本

④ SB：p38 抑制剂，SB203580

⑤ SP：JNK 抑制剂，SP600125

⑥ Vector：载体 (0.01% DMSO)

▐  实验细胞

前列腺癌细胞系 LNCaP 或 PC3 细胞

▐  目的一

CCK-8 实验检测 TRPM8 敲低 (siRNA) 对 LNCaP 和 PC3 细胞增殖的影响。

操作步骤

将转染和未转染的 LNCaP 或 PC3 细胞（每孔 5×10³）培养在 96 孔板中，每组十孔。加入新鲜培养基，孵育适当时间，加入10 µL CCK-8 工作溶液，混合物在 37°C 下再孵育 4 h。用酶标仪测定其吸光度。

实验结论

TRPM8 敲低抑制了 LNCaP 和 PC3 细胞的生长。与亲本 (Parental) 和 siCON 细胞 (CON，阴性对照) 相比，siTRPM8 细胞的生长在第 2 天受到显著抑制 (图 6)。

图 6. 通过 CCK-8 测定测量了 TRPM8 敲低对 (A) LNCaP 和 (B) PC3 细胞增殖的影响。

▐  目的二

使用 CCK-8 药敏试验评估 siTRPM8 对 EPI (Epirubicin) 化学敏感性的影响。

操作步骤

为了检查化学敏感性，细胞先孵育 12 h 以使其附着，再将细胞与载体 (0.01% DMSO) 或不同浓度 (0、200、400、600、800、1,000 ng/mL) 的 EPI 一起孵育 48 小时，进行 CCK-8 测定。以相对于对照组的百分比表示，对照组为 100%，并用含有培养基的载体 (0.01% DMSO) 处理。使用酶联免疫测定仪读取光密度。

实验结论

TRPM8 敲低增强了 EPI 诱导的生长抑制。与亲本细胞和 siCON 细胞相比，siTRPM8 细胞在与所示浓度的 EPI 孵育 48 h 后活力明显减弱，且呈剂量依赖性方式减弱 (图 7)。当用 600 µM EPI 处理时，siTRPM8 细胞的活力明显低于亲本和 siCON 细胞。

图 7. TRPM8 敲低显著增强了 EPI 诱导的 (A) LNCaP 和 (B) PC3 细胞活力抑制。

▐  目的三

CCK-8 测定分析了 p38 抑制剂 (SB203580，20 µM) 和 JNK 抑制剂 (SP600125，10 µM) 对 EPI 介导的 siTRPM8 细胞增殖抑制的影响。

操作步骤

为验证 MAPK 信号通路的作用，加入 EPI 前 2 小时将 p38 抑制剂 SB203580 (20 µM) 和 SP600125 (10 µM) 加入培养基中。通过 Cell Counting kit-8 检测确定细胞活力。

实验结论

p38 和 JNK 的特异性抑制剂减弱了 siTRPM8 对 EPI 化学敏感性的增强 (图 8)。

图 8. p38 和 JNK 的特异性抑制剂减弱了 siTRPM8 对 EPI 化学敏感性的增强。

本次小 M 为大家详细介绍了 CCK8 实验的基础应用和操作流程，希望能帮助大家顺利完成 CCK8 实验，迎接属于自己的科研小“茶歇”~