新应用 | 单细胞光导系统应用于iPSC细胞系开发

诱导多能干细胞（iPSC）的发现彻底改变了干细胞研究和细胞治疗。开创性的研究已经证明，仅使用四个遗传因子就可以将体细胞转化为iPSC ^[1]。启动分化为多种细胞类型的能力，加上新近开发出的技术，可以在体外长期维持培养，开启了再生医学、细胞治疗和精准医学的新时代 ^{[2, 3]}。

iPSC不仅在细胞疗法中具有巨大潜力^[4]，它们在创建疾病模型中的广泛应用更加值得关注。这些模型将推进我们对疾病机制的理解，为靶向治疗策略铺平道路 ^{[2, 5, 6]}。这些特定疾病的细胞系可作为药物筛选和测试针对个体遗传条件复杂性的新型治疗干预措施的宝贵平台。

为进一步利用iPSC技术在疾病模型方面的巨大潜力，简化iPSC细胞系开发成为一项重要任务。该过程需要生成具有一个或多个特定疾病相关突变的遗传修饰iPSC细胞系，以便下游分化为相关细胞类型。这个过程涉及从转染的iPSC池中分选或打印单细胞，然后进行扩增和选择。基因编辑技术的进展降低了这一过程的技术障碍。然而，iPSC是敏感的细胞，它们的多能性和自我更新能力可能会受到环境微小变化的影响 ^[7]。例如，根据使用的培养条件，单细胞克隆的ChiPSC18细胞在培养皿中的克隆效率（1%至28%）和多能性保留率（7%至97%）差异很大^[8]。因此，从单细胞建立克隆细胞系的低成功率是研究者长期面临的挑战 ^{[9, 10]}。这种低成功率导致需要准备数百个样本，导致劳动密集和成本上升，因为需要特定的培养条件，如基质和添加剂。

通过无缝集成尖端光导微流控、先进的自动化和高分辨率成像能力，布鲁克细胞分析开发的单细胞光导系统改变了研究人员探索细胞的工作方式（图1）。

图1. 布鲁克的Beacon^®系列单细胞光导系统整合了单细胞工作流程的诸多功能，利用专利光电定位（OEP™）技术和OptoSelect^®芯片的NanoPen^®小室实现对细胞的精准操控和多重分析。

这一创新系统以前所未有的通量和速度，使精确操纵和分析单个细胞成为可能，让研究人员能够加速工作流程并深入洞察细胞行为。在这份应用说明中，我们展示了针对iPSC细胞系开发定制化的工作流程（图2）：通过对OptoSelect^®芯片表面进行特殊处理来支持iPSC培养，将单iPSC加载到芯片和NanoPen^®小室中，并扩增克隆数天。然后，克隆iPSC自动导出到组织培养板中进行芯片外扩增和基因分型。在芯片外扩增后，我们展示了导出的iPSC克隆保留其未分化状态，没有自发分化的迹象。我们还讨论了在芯片上开展客户定制化分析，用于选择感兴趣的克隆，这有可能进一步节省时间和成本，并加深对iPSC行为的理解。

图2. 使用布鲁克的单细胞光导系统进行iPSC细胞系开发工作流程的示意图。*在这份概念验证应用说明中没有进行分析检测。

维持iPSC在非分化状态需要仔细考虑培养基和表面基质。优化OptoSelect^®芯片表面基质对于促进iPSC粘附和生长至关重要。布鲁克细胞分析提供贴壁细胞工作流程和相关试剂，以支持包括HEK293、HeLa以及间充质干细胞（MSCs）等特定细胞类型。也可使用其他试剂匹配不同细胞的培养表面的需求，如ChiPSC18细胞，我们选择使用Cellartis DEF-CS COAT-1进行表面处理（图3）。仅用Cellartis DEF-CS COAT-1处理整个芯片表面（通道和NanoPen^®小室）能够促进细胞扩增，但也会导致细胞从NanoPen^®迁移到通道中（图3D）。为了解决这个问题，我们对通道和NanoPen^®小室使用不同的表面处理，以防止细胞迁移到通道中，同时仍支持NanoPen^®内的细胞活性和扩增（图3C）。使用我们贴壁细胞工作流程，首先用润洗溶液处理通道区域，然后用Cellartis DEF-CS COAT1处理NanoPen^®小室（图3A, B）。在OptoSelect^®芯片上进行针对性表面处理的能力有效应对了基于微流控的细胞培养的关键挑战，也同时让我们看到单细胞光导系统和OptoSelect^®芯片可拓展的兼容性。

图3. 使用Cellartis基质处理OptoSelect^®芯片的表面。顶部视图（A）和侧面视图（B）的示意图，展示定制化的芯片表面处理流程，用于培养诱导多能干细胞（iPSC）。仅使用Cellartis基质时的细胞扩增（C）以及使用Cellartis基质加上非贴壁表面时的细胞扩增（D）。

确保iPSC细胞系开发中的克隆性和产量至关重要。使用先进的单细胞光导系统上的OptoSelect^®芯片，可以通过光电定位（OEP）技术将通道内的单个细胞移动到邻近的NanoPen^®小室中，这将最大化单细胞导入效率（图4A）。导入后，细胞在DEF-CS培养基（Takara, Y30017）中培养三天。在此期间，我们观察到细胞粘附和限制在NanoPen^®腔室内的单细胞扩增（图4B, C）。这些结果证明了布鲁克的单细胞光导系统能够以高度并行和自动化的方式分离、培养和追踪单iPSC细胞。基于持续的灌注培养、独特的NanoPen^®小室设计和高局部细胞密度等技术特征，OptoSelect^®芯片上的单细胞克隆扩增效率已被证明高于传统方法：使用代表性的CHO细胞系，整体克隆效率Beacon^®为52%，FACS为11%，有限稀释为5.7% ^[11]。此外，该系统只要求用户准备仪器和提供单细胞悬液和培养基，大大减少了手动操作时间，同时提供比传统方法高得多的克隆效率。

图4. OptoSelect^®芯片上单个iPSC导入和扩增过程。A) OEP将单个iPSC移动进入NanoPen^®；B) 单个iPSC在NanoPen^®中能够扩增；C) 24小时内芯片上的细胞持续扩增。

在iPSC克隆扩增后，我们使用TrypLE将芯片上的贴壁细胞解离，并将单克隆iPSCs从特定的NanoPen^®导出到预处理的组织培养板中指定的孔里。自动化的导出过程包括在NanoPen^®底部产生气泡来解离细胞，在利用OEP将解离的细胞移动到通道中，最终将通道中的克隆细胞导出到预充满培养基的孔中（图5A）。单细胞光导系统为孔板内的细胞提供精确控制温度、CO₂、O₂和湿度等培养条件，即使在长时间的导出期间也能保持细胞的稳定。导出后，我们将组织培养板转移到传统的细胞培养孵箱中进行芯片外扩增。在导出约两周后，从导出的克隆中衍生的iPSC克隆展现出强劲的扩增能力。这种自动化的导出过程便于从OptoSelect^®芯片中导出所需的iPSC克隆，并且克隆率可以超过99% ^[11]。

图5. 克隆导出和iPSC克隆的芯片外扩增。A) 气泡解离后，通过OEP从选定的NanoPen^®中导出单个iPSC克隆到组织培养板的预定孔中。B) 从导出的克隆iPSCs中扩增出的克隆在组织培养板中的示例。

在整个细胞系开发过程中保持回收的iPSC克隆的多能性至关重要。Oct-4和Sox-2转录因子被广泛认为是干细胞多能性的标志物。对批量的iPSCs和导出的iPSC克隆进行免疫细胞化学测定，确认了Oct-4和Sox-2转录因子的存在（图6）。这些结果证明了iPSC克隆在芯片外扩增后保留了多能性干细胞标志物。这一结果展示出了我们的单细胞光导系统与iPSC细胞系开发的兼容性，提供了比传统方法高五倍的克隆效率，且手动操作时间不到传统方法的20%。

图6 | 使用多能性标记Oct-4和Sox-2对对照iPSCs和导出的iPSC克隆进行免疫化学染色。

在这份应用说明中，我们详细说明了布鲁克的单细胞光导系统如何加速和自动化iPSC细胞系开发过程。该系统在促进iPSC克隆选择方面也具有巨大潜力。系统提供集成的明场和荧光成像，以及完全自动化的流体系统，可以促进表型选择。例如，如果所需的iPSC克隆需要基于荧光进行选择，用户可以利用我们的成像分析软件选择阳性克隆（例如，表达荧光蛋白或芯片上染色后的克隆）。用户还可以基于功能表征选择克隆，利用增殖、运动和离子通道流（如钙流）等检测。此外，对于基因分型，用户可以选择从NanoPen^®导出部分细胞到PCR板进行测序，同时使用贴壁细胞分割导出工作流程在芯片上培养剩余的细胞。在导出用于基因分型的细胞后，用户可以选择从选定的NanoPen^®小室导出剩余的细胞进行芯片外扩增和验证。总之，这项技术提供了多种可定制的检测方法，以促进快速克隆选择。

布鲁克公司（Nasdaq:BRKR）的高性能科学仪器和高价值分析诊断解决方案使科学家能够在分子、细胞和微观层面探索生命。

Bruker Cellular Analysis可提供从发现到临床研究所需的对每个细胞表型组（Phenome）的深入了解。

单细胞光导平台Beacon^®基于其特有的光电定位技术（OptoElectro Positioning, OEP™）为广大科学家提供了先进的研究手段，对数以万计单细胞的基因信息、功能等进行深入表征，以筛选出满足用户需求的目的细胞。Beacon^®应用场景涵盖抗体发现、细胞株开发、传染病研究、免疫学研究、肿瘤生物学研究、细胞疗法开发、基因编辑、农业科学等多个领域，为从事尖端的科研项目及加速企业生物产品的开发提供了前所未有的机遇。

单细胞蛋白质组学平台IsoSpark™及IsoLight™是单细胞多组学不可或缺的重要组成部分，在临床科研领域，针对评估和检测人体单细胞免疫能力、筛选癌症治疗方案、预测评估临床疗效及安全性等方面有着丰富的成功经验，为预测病人长期生存、早期筛选治疗获益患者提供了详实的参考数据，探索并建立实验数据与临床结果的相关性，帮助世界各地的科研人员在肿瘤免疫、细胞治疗、肿瘤学、抗感染免疫研究及疫苗开发、自身免疫病、移植免疫等方向取得了众多突破性成果，助力加速临床科研、医学和生命科学行业发展。

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