【治疗新思路】30种免疫细胞亚型+3群TIL细胞/FACSymphony™ 助力肿瘤免疫微环境以及分子特性探究

肺癌是致死率最高的癌症之一，其中大部分的患者都确诊为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）：肺腺癌（adenocarcinoma，LUAD）和肺鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，LUSQ）是最常见的两个亚型。对于NSCLC，免疫疗法会产生较高概率的耐药性。肿瘤浸润淋巴细胞（tumour-infiltrating lymphocytes，TIL）在肿瘤免疫过程中发挥着不可忽视的作用，其组分构成、活化和细胞状态对于肿瘤治疗，尤其是免疫疗法都起到了非常重要的调控作用。截止到目前，非小细胞肺癌肿瘤微环境以及肿瘤浸润淋巴细胞组成和分子特性尚不明确。《Cancer Research Community》近期发表的一篇关于鉴定NSCLC局部TIL细胞亚群分子特征的文章。

阻断免疫检查点（immune checkpoint）能够为多种癌症提供治疗靶点。但实际临床治疗效果并不符合预期，比如靶向PD-1/PD-L1的治疗只对20%的非小细胞肺癌（NSCLC）病人具有较好的治疗效果，其他病人存在不同程度的耐药性。耐药性最主要的原因是免疫抑制的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）。由于肿瘤微环境受多种因素影响，在不同肿瘤案例中都存在差异，所以开发更加特异的免疫疗法至关重要。

肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating leukocytes，TIL）的成分、激活状态显著影响着免疫疗法的效果。至今为止，肿瘤微环境的免疫状态、和非小细胞肺癌真正的免疫细胞组分都没有被真正解析。因此，解析NSCLC肿瘤微环境中浸润淋巴细胞的特征，对于解决免疫治疗耐药性、精准医疗都至关重要。

图示为NSCLC肿瘤免疫微环境

来自日本国际癌症中心的Atsushi Ochiai和其合作者发现了非小细胞肺癌中三种具有不同信号通路和基因突变的免疫细胞亚群，为靶向非小细胞肺癌的免疫治疗提供了新的见解，从而为个体化精准治疗NSCLC提供了新思路。

首先，作者基于BD FACSymphony™ 平台的高通量流式细胞技术（BD FACSymphony™ A5）从NSCLC肿瘤组织和肿瘤邻近正常组织（normal tissue adjacent to tumor，NAT）样本中鉴定到了30种免疫细胞类型。作者们比较了LUAD和LUSQ两个癌症亚型肿瘤浸润淋巴细胞TIL的数量和种类，发现这两类来源的免疫细胞的特性有所差别，比如LUSQ组织中TIL细胞密度、CD8+T细胞与自然杀伤T（NKT）细胞的比重更高；而LUAD来源样本中CD4+T细胞和巨噬细胞比重较高。同样，作者们发现，确认癌症分化状态和临床病理因素与免疫细胞类型有一定相关性，如在分化程度较轻的LUSQ组织中，CD4+naïve 调节性T细胞的比重较高；LUAD肿瘤中CTLA-4+ 效应调节T细胞（effector regulatory T cells，eTreg）细胞比重较高；与CD8+ NKT细胞的比重高度相关。

LUAD和LUSQ来源免疫细胞构成

接下来，作者根据流式分选的结果采用BD FlowJo™ 的非监督分簇Ward.D2算法将来源于LUAD和LUSQ的免疫细胞主要分成三个肿瘤浸润淋巴细胞亚群，根据TIL的数量和类型，分别定义为Cold亚型（Cold）、髓系细胞主导亚型（Myeloid）、CD8+T细胞主导亚型（CD8）。Cold亚型中浸润的免疫细胞数量明显少于其他两个亚型，髓系细胞主导亚型和CD8+T细胞主导亚型中TIL分别是免疫抑制的髓系细胞（包含巨噬细胞，CD14+单核细胞等）和效应T细胞。流式分选的结果和后续免疫组化的染色图片都证明了这三个类群的特性。

LUAD和LUSQ来源免疫细胞构成

紧接着，作者评估了上述三种细胞类型分群的临床意义。他们分析了三种不同TIL类群的组织病理特性，以及和病人预后的相关性。LUAD亚型中，EM CD8+T细胞的比重和更好预后高度相关，CD8亚群的病人EFS（无事件生存，Event Free Survival）评分高于髓系细胞亚群。LUSQ亚型中，mMDSCs和CD4+ NKT细胞和较差预后紧密相关，CD8亚群的EFS评分高于其他两群TIL细胞。

 不同免疫亚型患者的预后

然后，作者通过分析基因表达、TCR多样性、免疫反应性、免疫检查点分子表达、代谢组，对三种TIL亚群的免疫激活程度进行评估。在LUAD和LUSQ两类肿瘤亚型中，CD8亚群细胞高表达免疫激活基因：IFNγ、颗粒酶B，与免疫检查点分子：PD-1、PD-L1、TIM3、LAG3。LUAD的CD8亚群还具有更高的TCR多样性。

基于TIL分析的免疫亚型的免疫学特征

最后，根据GSEA基因富集结果，作者们鉴定出了三种TIL细胞类群中特异的基因表达通路。对于LUAD和LUSQ两个亚型，Cold亚群细胞中高表达TGFβ通路；髓系细胞亚群中高表达糖酵解和K-ras信号通路；CD8亚群中高表达免疫相关基因：IFNα、IFNγ、同种移植排斥（allograft rejection）。对于NSCLC组织中TIL亚群分子特征鉴定能够为个体化精准医疗提供新的切入点和治疗靶点。

代表LUAD(A)和LUSQ中表达量增加和减少的基因富集的得分最高通路的热图

用于识别非小细胞肺癌中TILs免疫细胞谱的门控策略：

在肿瘤免疫疗法首次开发后，人们对肿瘤抗药性、免疫抑制的了解逐渐深入，对个性化精准医疗的需求逐渐增加。本篇文章利用BD FACSymphony™ 平台，结合转录组和代谢组分析，在非小细胞肺癌组织中鉴定到了三群生化性质、分子特性明显不同的肿瘤浸润淋巴细胞，为个性化解决肿瘤免疫疗法耐药性提供了新思路和发展方向。