疏水性肽段与蛋白分离最新研究成果，月旭科技提供关键支持！

2024-04-15 20:27:41, 产品市场部月旭科技（上海）股份有限公司

（图片来源：wangluo）

近日，一种可以轻松获取膜相关镜像蛋白的增溶性标签移除方法被成功开发。研究成果来自中国科学技术大学在《Angewandte Chemie》上发表的题为“An Enzyme-Cleavable Solubilizing-Tag Facilitates the Chemical Synthesis of Mirror-Image Proteins”的科研论文。

该项研究使用了月旭科技的Ultimate^® XB-C4和XB-CN柱分别在镜像的^DIgV^PD-1和^DE蛋白化学合成中实现了疏水的肽片段及膜相关蛋白的良好分离。同时，利用Ultimate^® XB-C18半制备柱实现合成粗肽的批量纯化。

Angewandte Chemie

背景介绍

镜像多肽配体与天然多肽相比具有抗蛋白酶水解和免疫原性低的特点，具有显著的治疗潜力。这类镜像多肽配体通常是对靶标蛋白的镜像版本进行镜像噬菌体筛选获得。这类镜像靶标蛋白目前只能由蛋白质化学全合成获取。然而，许多膜相关镜像靶标的合成仍具有挑战，因为他们的溶解度差，易聚集，使得这些多肽的连接变得困难。

（图片来源：wangluo）

使用可切割的Linker将增溶标签安装在疏水肽段上是克服这一困难的一种方法，可裂解的Linker选择是关键，因为它必须在蛋白组装过程中稳定，并且易于切割以提供目标蛋白。当前Linker可通过酸、碱、过渡金属、亲核试剂、光等作用完成裂解，但对于一些困难的目标，如PD-1等，可能会存在裂解效率低，选择性差，产物可能分解等问题。这些问题迫使我们去开发一种更加高效、温和、高选择性的增溶标签移除方法，以便轻松获取膜相关镜像蛋白。

文章概述

研究报告了一种可以在变性条件下温和、高效、且高选择性移除D-蛋白中增溶标签的酶促策略。策略的关键是使用Lys-C酶特异性识别和切割天然赖氨酸的羧酸末端的特点，以天然的赖氨酸作为Linker，轻松安装在多肽的N端，^DSer，^DThr和^DLys的侧链。

与之前传统的化学脱除方法相比，酶法条件温和，选择性高，特异性强，且和镜像蛋白的骨架正交，安装的增溶标签兼容蛋白化学合成的多个过程，例如：肽片段的连接，脱硫，过度金属脱保护等。利用该策略，我们成功合成了镜像的^DIgV^PD-1和蛋白^DE。

（图片来源：wangluo）

研究成果快览

1. 镜像的^DIgV^PD-1蛋白的化学合成

多肽17-20 RP-HPLC分析色谱条件：

色谱柱：Ultimate^® XB-C4，(4.6×250mm，5μm）

流动相：A: 乙腈（包含0.1% TFA） B: 水（包含0.1% TFA）

检测波长：214/254nm

流速：1.0mL/min

洗脱程序：20-70%A，30min

图1：通过Lys-C裂解增溶标签的

酶促策略化学合成^DIgV^PD-1

(a) ^DIgV^PD-1的氨基酸序列

(b) ^DIgV^PD-1的合成路线

(d) 纯化的21的SDS-PAGE和ESI-MS

(e) 合成^DIgV^PD-1和重组^LIgV^PD-1的CD光谱

结论：利用上述策略，研究人员将镜像^DIgV^PD-1分成了4段，在其中疏水的片段使用该策略安装了增溶标签，最终成功合成和获取了镜像的^DIgV^PD-1蛋白。在该实验中，使用Ultimate^® XB-C4柱实现了相关肽段的良好分析。

2. 镜像的^DE蛋白的化学合成

纯化肽24 RP-HPLC分析色谱条件：

色谱柱：Ultimate^® XB-CN，(4.6×250mm，5μm）

流动相：A: 乙腈（包含0.1% TFA） B: 水（包含0.1% TFA）

检测波长：214/254nm

流速：1.0mL/min

洗脱程序：10-90%A，30min

图2：通过 Lys-C裂解增溶标签的

酶促策略化学合成^DE蛋白

(a) ^DE蛋白的氨基酸序列

(b) 肽22′和22在水溶液（6M Gn-HCl，100mM 磷酸盐，pH7）中的溶解度

(d) 纯化的24的HPLC分析和去卷积ESI-MS

(e) 纯化的25的去卷积ESI-MS

(f) 合成^DE蛋白和重组的^LE蛋白光谱

结论：研究人员将镜像膜蛋白E分成了两段，使用该策略在两段上安装了增溶标签，最终成功合成和获取了镜像膜蛋白^DE。在该实验中，使用Ultimate^® XB-CN柱实现了疏水的膜相关蛋白的良好分离。

3. 粗肽纯化

图中的2，5，7，9，11多肽使用了制备柱进行纯化，色谱条件：

色谱柱：Ultimate^® XB-C18，(21.2×150mm，5μm）

流动相：A: 乙腈（包含0.1% TFA） B: 水（包含0.1% TFA）

检测波长：214/254nm

流速：1.0mL/min

洗脱程序：0-40%A，30min

图 3：Lys-C催化移除不同氨基酸上的增溶标签

(a) ^DLys处的裂解

(b) ^DSer处的裂解

(d) ^D肽N端的裂解

(e) 和 (f) 3和5个增溶标签的裂解

(g) 和 (h) D肽(11)和L肽(12)在Lys-C裂解条件下的稳定性

多肽反相分离中色谱条件的选择：

色谱柱选择：基于不同序列多肽样品的理化性质及疏水性的差异去选择合适的键合相，“月旭助力中科大郑基深团队在国际一流期刊《Angewandte Chemie》发表论文” 点击文章链接了解详情。

这里需要强调一下：对于多肽等生物类样品有高灵敏度分析需求的老师，可选用月旭金刚石镀层柱管色谱柱，该系列的色谱柱可有效降低具有生物活性的样品与柱管的特异性吸附，帮您获得更优的色谱峰形。

（图源：baotu）

流动相添加剂选择：基于多肽的结构特点-肽上的大量带电侧链会降低疏水性表面对肽的吸附性，尤其是碱性肽侧链通过与硅醇相互作用结合至色谱柱，易产生峰拖尾的问题。对此我们流动相通常选择TFA体系（低pH使酸性肽侧链质子化，形成离子对中和碱性肽侧链，电荷量减少增大疏水性表面对肽的吸附性，碱性肽不与硅醇结合）或磷酸盐体系（将流动相的pH值增加至6~7将会使羧酸基团离子化，减弱多肽的疏水性）。

洗脱类型：肽类样品的分析中大多采用梯度洗脱，目的是为了在较短时间内得到良好的分离度，并使色谱峰形更窄更对称。

产品信息

货号	产品描述
02610-21105	Ultimate^® XB-C18，5μm，21.2×150mm
00216-33043	Ultimate^® XB-C4，5μm，4.6×250mm
00205-31043	Ultimate^® XB-CN，5μm，4.6×250mm