声光偏转器（AODF）在高速荧光成像中的关键作用：FIRE技术简介

在上一篇文章中(声光偏转器（AODF）在高速细胞分选中的关键作用：ICS技术简介)，我们学习了发表在Science上的“High-Speed Fluorescence Image-Enabled Cell Sorting”，其中通过AODF实现了一种基于高速荧光成像的细胞分选技术。而这份速度是由FIRE高速荧光成像系统带来的，即使用射频标记发射的荧光成像系统。最初是由来自加州大学洛杉矶分校的Eric D. Diebold, Brandon W. Buckley等四位科学家于2013年发表于Nature Photonics的“Digitally synthesized beat frequency multiplexing for sub-millisecond fluorescence microscopy”这篇论文中提及。

FIRE技术（fluorescence imaging using radiofrequency-tagged emission）是将一种射频通信的方法应用于高速荧光显微镜，同时结合了PMT的灵敏度和速度优势，并利用频域信号复用、射频频谱数字合成以及数字锁相放大，实现了千赫兹帧率的荧光成像，解决了EMCCD或者sCMOS用于流式细胞术速度不足的问题。而FIRE的核心特征在于样品上每个单独点均能够以不同射频激发荧光。在两束移频激光之间干涉所产生的拍频处，数字合成的射频“标记”了荧光发射的各个像素点。这和无线通信系统中的频率多路复用类似，FIRE图像的一行内的每个像素点都被分配了自己的射频。单元光电探测器同时检测多个像素的荧光，并从探测器输出的频率分量中重新构建图像（运用数字域的并行锁相放大来分辨）。

样品中每个点能以不同的射频来激发荧光的秘诀在于其中的马赫-曾德尔干涉仪（MZI），并使用声光器件来执行拍频激发多路复用。如上图a所示，MZI一路的光通过声光偏转器（AODF）产生频移（带宽为100MHz），由射频频率梳驱动，相位经过设计以最小化峰值-平均功率比。AODF产生多个偏转光（+1级衍射光），包含一系列的偏转角度和频率偏移。MZI干涉仪第二路光通过声光移频器（AOFS），该移频器由单个射频频率驱动，提供本振（LO）光束。使用柱面透镜来匹配LO光束与射频梳光束的发散角。在MZI干涉仪输出的位置，两束光通过分束器合并聚焦到样品的一条水平线上，将频率偏移映射到空间。

荧光在由干涉仪两路的差频所定义的各个拍频下被激发。样品中的荧光发射由共聚焦配置的PMT检测，并且通过狭缝来排除平面外的荧光发射。共振扫描振镜（RS）在横向上进行高速扫描，即可以二维成像。考虑到荧光团的有限频率响应，选择LO光束的频移将拍频激发频谱外差到基带，以最大限度利用调制带宽。这是必要的，因为AOD通常在升频的次倍频通带上工作，以避免谐波干扰。用于驱动AOD的射频频率梳的直接数字合成（DDS）定义了每个像素的激发，而这是通过特定的射频和相位决定的，从而导致射频频率梳与检测信号之间的相位相干性。而这种相位相干性可以使用相敏数字锁相放大器的并行阵列使得图像多路分解，这可以在Matlab中实现。FIRE的并行读出将导致最大像素速率等于AODF的带宽。

图2显示了FIRE显微镜的典型输出。检测到的时域信号(图2a)是来自一排像素的射频标记发射的傅里叶叠加。使用短时傅里叶变换计算的时间分辨频谱(图2b)揭示了样本在水平行内位置相关的频率成分。而样本的垂直位置是从2.2KHz共振扫描镜的参考输出中恢复出来的，最终形成了二维的图像（图2c）。

在这里AOD有三项指标至关重要，可分辨点数（扫描角度），功率平坦化，扫描速度。AOD的带宽越大，自然扫描的角度也越大，可分辨的点数也越多。扫描时间意味着不同频率间切换的时间，自然也和成像的速度息息相关。而功率平坦化是AOD晶体和驱动器共同优化的结果，为了在扫描的带宽内获得近似的衍射效率，不会使得扫描获得的线性激光阵列中间亮两边暗，提供均匀的激发光。

G&H声光偏转器（AOD）可以提供适用于不同波长的型号，在不超过几度的范围内，分辨出成百上千个点，扫描时间可以快至几微秒。G&H为AOD提供光束的精确空间控制，无论是执行1D或2D扫描还是执行固定角度的光束偏转。我们的声光偏转器可在整个扫描角度上提供高度均匀的衍射效率，并为材料处理和数字成像等扫描应用提供一致的功率通过量。

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