吉非替尼-PROTACs-3药物的高灵敏度生物样品分析方法

PROTACs（Proteolysis Targeting Chimeras，即蛋白水解靶向嵌合体）是利用细胞内泛素-蛋白酶系统对靶标蛋白进行降解的新型药物。该类药物分子结构类似哑铃，包含三个主要区域：i）靶标蛋白配体ii）连接器（linker）iii）E3泛素连接酶招募配体，见图1。PROTACs分子的一端与靶蛋白结合，另一端与E3泛素连接酶结合，从而可以在体内将靶蛋白和E3泛素连接酶拉近，使靶蛋白被泛素标记，然后通过蛋白酶体降解，实现靶标蛋白的翻译后敲除。

图1. PROTACs介导的蛋白酶降解途径。

PROTACs药物与传统小分子化学药物“占位驱动”形式不同，传统化学药物需要与靶蛋白的结构域形成稳定连接、具备足够的活性才有成药性，要足够高的剂量使靶点饱和，同时要足够长的半衰期实现长久抑制靶蛋白。而PROTACs药物促使靶蛋白降解之后就可以从复合物解离出来进入下一个催化循环，不需要很高的结合活性，借助催化活性用低剂量长周期就可以达到治疗效果。PROTACs分子具有巨大潜力，但是由于分子结构复杂，分子质量较大，化学稳定性差，药物浓度低，给DMPK研究中的生物样品分析方法建立带来了很多挑战。

本案例中基于Waters UPLC-TQ液质联用系统开发了吉非替尼-PROTACs-3药物的生物样品分析方法，使用一步法蛋白沉淀就可实现血浆中该药物的高灵敏度检测，定量下限20 pg/mL，线性范围可达到5个数量级20 pg/mL~1,000 ng/mL，方法验证结果表明了方法的准确度和稳定性，可用于吉非替尼-PROTACs-3药物的DMPK研究。

图2. 吉非替尼-PROTACs-3和吉非替尼结构式。

PROTACs生物样品分析方法开发

质谱参数优化

采用MassLynx Intellistart软件，优化MRM离子对和离子源参数。优化结果如下：

液相条件的优化

通过色谱柱筛选，流动相、梯度的调整，减少由于PROTACs结构中多手性中心导致的色谱峰分裂，获得良好的峰形，提升目标化合物信号。优化后采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 x 150 mm，1.8 μm），水溶液和乙腈作为流动相加入0.1%甲酸和1 mM乙酸铵调节pH和离子强度，5%~95%梯度变化，4.1 min分析时长，柱温采用60 ℃，进样量2 μL。

图3. 20 pg/mL 吉非替尼-PROTACs-3 LC-MS/MS色谱图。

样品前处理

采用1:3乙腈蛋白沉淀的方式，低温操作。

线性范围

线性范围可达到5个数量级（20 pg/mL~1,000 ng/mL），采用内标法1/x权重计算。

图4. 吉非替尼-PROTACs-3线性范围20 pg/mL~1,000 ng/mL。

总 结

PROTACs类药物的相对分子量较大，一般在700-1,000 Da，在质谱分析离子化过程可能形成多电荷离子，MRM离子对优化过程中不能局限在只寻找单电荷离子，同时需要注意离子源参数优化，减少裂解，提高灵敏度。受到化合物结构的影响，液相色谱分离条件的优化需要充分考察色谱柱、流动相及柱温的影响，减少色谱峰分裂。另外，需要充分考虑基质的稳定性，提升方法的可靠性和测试结果的稳定性。