新年的香味！基于UHPLC-MS/MS揭示咖啡豆烘焙过程中脂质的动态变化

2024-02-29 13:41:00, 徐秋会艾杰尔-飞诺美（Agela & Phenomenex）

本文转自：“油料脂质分析实验室”微信公众号

今天分享一篇2023年9月发表在Food Research International ( IF =8.1 )的文章，题目是“Revealing the dynamic changes of lipids in coffee beans during roasting based on UHPLC-MS/MS”。该研究的共同通讯作者是来自中南民族大学周莉副教授与付海燕教授和中国农业科学院油料作物研究所的魏芳研究员。周莉副教授研究方向为脂质组学、代谢组学质谱新方法的构建及其在食药品种鉴定、产地溯源、疾病预防与调控中的应用。

● 1. 研究背景 ●

咖啡是世界上消费最多的饮料之一，其高营养价值和经济重要性使其非常受欢迎。独特的感官体验和宜人的风味强烈影响和决定咖啡饮料的质量，是最重要的消费参数。咖啡已被证明对人类健康具有有益作用，包括预防 2 型糖尿病、慢性肝病和某些类型的癌症，它可以作为我们乳制品生活中潜在的功能性食品。

烘焙对最终产品有重大影响，是咖啡加工链中最关键的步骤，工业烘焙过程可分为 3 个阶段：干燥、风味和色泽的形成以及冷却。在烘焙过程中，生咖啡豆要经受高温(200–240 °C)，加热时间从 12 到 20 分钟不等，以获得最终产品，然而，与更高温度下的烘焙相比，在 200–210°C 下烘焙咖啡豆可以产生更好的风味。大量已发表的研究表明，咖啡中挥发性和非挥发性成分的含量和组成很可能对咖啡的风味产生重大影响。此外，咖啡中大多数这些令人愉快的气味分子是由于许多化合物的形成或降解而形成的，例如不溶性碳水化合物、可溶性碳水化合物、脂质、绿原酸、蛋白质和游离氨基酸。在这些香气中，脂质在咖啡豆或咖啡酿造的发展中发挥着重要作用。在烘焙过程中，脂质会发生自氧化和分解反应，这些反应有助于香气的形成，对咖啡饮料的风味非常重要。研究表明，由于某些气味物质的亲脂性，与蛋白质和碳水化合物相比，脂质具有最强的香气保留能力。并且脂质吸收疏水性风味成分，从而显着有助于产品的味道。本研究采用UHPLC-MS/MS测定了咖啡豆的脂质分子种类及其在烘焙过程中的代谢变化，并通过脂质组学分析结合化学计量学研究了不同烘焙时间下脂质的变化。据我们所知，这是第一篇全面表征咖啡脂质在烘焙过程中动态变化的深入研究。

● 2. 研究内容 ●

2.1 咖啡烘焙和样品制备

咖啡豆样品采自中国云南省，研究样本来自同一批次。选择200 ℃的烘焙温度是为了更好地保留咖啡豆的营养价值并发挥咖啡豆的风味。将咖啡豆样品分为 5 组进行不同的烘焙时间，所有样品均进行 4 次重复烘焙。烘焙过程在咖啡烘焙机中进行，每批烘焙50克咖啡豆。每批咖啡豆在 200 °C 下进行0分钟、4分钟、8分钟、12分钟和 16分钟的烘焙。

2.2 脂质提取

将约2g咖啡粉悬浮于60mL MeOH/MTBE (1:2, v/v )、IPA/CH₂Cl₂(1:1, v/v ) 、MeOH/CH₂Cl₂ (2:1,v/v )和CH₂Cl₂/MeOH(2:1,v/v )不同溶剂中，室温下超声30分钟。随后，将混合物离心 10 分钟。离心后，将上清液转移至新管中，重复提取沉淀两次。然后将提取液收集在一起，用旋转蒸发仪真空蒸发(40℃,350kPa)，残余物氮气下干燥至达到恒重。提取的脂质储存在−20°C 下直至进行脂质组学分析。

2.3 UHPLC 分析

采用Phenomenex Kinetex C18 色谱柱(100 × 2.1 mm，2.6 μm)和流动相(A：甲醇/水/乙腈 = 1:1:1，v/v/v；5 mM醋酸铵；B：乙腈/异丙醇 = 1:5，v/v; 5 mM 醋酸铵)用于分离咖啡粉中提取的脂质。并以负电离和正电离模式获取数据，质量范围为m/z 120–1800。

2.4 脂质鉴定

通过 UHPLC-MS/MS 检测脂质，并使用 MS-DIAL(4.90)进行鉴定,经过脂质鉴定和数据过滤后，获得包含脂质名称、m/z 、保留时间（RT）和峰强度的列表，该信息用于进一步的定量分析。

2.5 质量控制(Qc)

本研究中，QC 样品的制备是通过等体积混合所有测试的咖啡样品来进行的。在整个运行批次中，每五个实验样品中注入 QC 样品。为了保证结果的可靠性，注射顺序是随机的，并且需要提取空白。在仪器上连续分析同一批次的所有样品。

● 3. 结果与讨论 ●

3.1 比较脂质提取所用溶剂

脂质提取作为样品制备中的关键步骤，对于降低样品的复杂性和富集感兴趣的化合物具有重大影响。四种溶剂分别提取咖啡豆的脂质如Fig. 1所示，正离子模式和负离子模式下的总离子色谱（TIC）峰强度分别为Fig. 1A 和1B，可以看出MeOH/CH₂Cl₂(2:1,v/v )提取的咖啡豆中脂质的TIC强度是最高的，Fig. 1C显示了四种提取溶剂的化学特征总量，这表明用MeOH/CH₂Cl₂ (2:1,v/v )提取的脂质样品中获得了最高数量的化学特征。综合考虑脂质覆盖率和响应强度，选择MeOH/CH₂Cl₂ (2:1,v/v )作为提取咖啡豆脂质的最合适溶剂。

Fig. 1. Total ion chromatography peak intensity of lipids detected of roasted coffee bean extracted by different solvents, in both (A) positive mode and (B)negative mode, (C) total number of chemical features.

3.2 咖啡豆脂质的分离与鉴定

通过精确的质量值、MS/MS 碎片和保留时间来鉴定脂质分子种类。以几种高含量的脂质分子为例来展示MS²裂解途径(Fig. 2)。ESI(+)模式下的PC(16:0_18:2) (m / z 758.5694) MS²碎片谱如Fig. 2A所示。m / z 184.0733处的碎片是PC的胆碱头基[C₅H₁₅NO₄P]⁺，m / z496.3398 代表亚油酸酰基的中性损失，m / z 520.3398 ，m / z 241.0119 分别代表棕榈酸酰基的中性损失。随后，H₂O的丢失导致产生m / z 480.3449和m / z 504.3449的碎片离子。Fig. 2B显示了PI(16:0_18:2)( m / z 833.5186)在ESI(-)模式下的MS²裂解谱,PI 的肌醇头基 [C₆ H₁₀O₈P] ^-( m / z 241.0119)和特征碎片[C₉H₁₄O₉P] ^-( m / z 297.0359)。m / z 255.2330处的碎片离子来自棕榈酸，m / z 279.2330 峰代表亚油酸脂肪酰基链。TAG (16:0_18:2_18:2) (m / z 854.7363)在正离子模式下的MS²碎片谱如图Fig. 2C所示。m / z 855.7436和m / z 872.7701被鉴定为[M + H]⁺和[M + NH₄ ]⁺的电离加合物。前体离子m/z 575.5034处代表亚油酸酰基和水的中性丢失，同样m/z 599.5034处代表的棕榈酸酰基和H₂O的中性丢失。根据MS²碎裂模式共鉴定出105种脂质，可分为TAG、DAG、SL和GP。在这些脂质中，检测到了53种TAG，约占脂质总数的一半，其次是28种GP和14种SL。

Fig. 2. MS/MS fragmentation pathway of: (A) PC (16:0_18:2) (m/z 758.5694) in ESI (+) mode (B) PI (16:0_18:2) (m/z 833.5266) in ESI (-) mode; (C) TAG (16:0_18:2_18:2) (m/z 854.7363) in ESI (+) mode. PC: Phosphatidylcholine; PI:Phosphatidylinositol; TAG: Triacylglycerol.

3.3 烘焙过程中咖啡豆总脂质含量变化

将同一亚类中不同脂质的含量相加，得到脂质亚类的百分比，结果如Fig. 3所示。五组咖啡豆样品中共检测到TAG、PC、PI、DAG、LPC、LPI、Cer、PE、HexCer、PA、LPE、CL等12个脂质亚类。脂质注释结果显示，咖啡豆样品中脂质的组成和含量存在差异，但 TAG 是生咖啡豆(67.49%)和烘焙咖啡豆(4 分钟，64.07%；8 分钟，54.38%；4 分钟，54.38%;12 分钟，63.92%；16 分钟，65.31%)中最丰富的脂质类别。此外，不同烘焙程度的咖啡豆中PC和PI的含量也较高，约占总脂质的10%~20%。

Fig. 3. Lipid composition (%) of coffee bean at different roasting times. (A) 0 min; (B) 4 min; (C) 8 min; (D) 12 min; (E) 16 min.

3.4 烘焙咖啡豆对脂质亚类的影响

为了更好地了解咖啡豆烘焙过程中脂质分布的动态，通过比较每个脂质亚类的总含量进行热图可视化(Fig. 4)。此外，通过脂质组学研究了四种特征脂质分子在烘焙过程中的动态变化，结果绘制在Fig. 5中。

Fig. 4. Heatmap of the metabolic variations of individual lipid subclasses during coffee bean roasting process.

Fig. 5. Trends of characteristic lipids during the roasting process. (A) PC (16:0_18:2); (B) PI (16:0_18:2); (C) TAG (16:0_18:2_18:2); (D) DAG (16:0_18:2). PC: Phosphatidylcholine; PI: Phosphatidylinositol; TAG: Triacylglycerol; DAG: Diacylglycerol.

Fig. 4显示咖啡豆烘焙过程中的代谢变化在整个脂质组中普遍存在。在磷脂亚类中，生咖啡豆中的 PE 和 LPE 含量高于烘焙咖啡豆，这意味着它们比其他豆类更容易降解。其他磷脂，如PI、LPI、PC、LPC和PA，在烘焙开始时表现出增加的趋势，然后开始减少。例如Fig. 5A和Fig. 5B所示，PC (16:0_18:2)和PI (16:0_18:2)的含量在加热开始时呈增加趋势，在烘焙8 min时达到峰值，随后开始下降。烘焙初期，由于细胞膜损伤导致磷脂释放增多，磷脂含量增加。然而，在烘焙结束时，磷脂含量逐渐下降。可以假设不饱和磷脂损失是由于降解或氧化造成的。烘焙过程中TAG (16:0_18:2_18:2)和DAG (16:0_18:2)含量动态如Fig. 5C和Fig. 5D所示。在烘焙初期，TAG (16:0_18:2_18:2)含量下降，而DAG (16:0_18:2)含量增加，推测是少量TAG被水解，导致咖啡豆中 DAG 的上调和脂质分布的轻微变化。

3.5 多元统计分析

为了更好地了解烘焙对咖啡豆脂质的影响，对咖啡豆的脂质谱进行了多变量统计分析。建立正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)模型，结果如Fig. 6所示。不同烘焙阶段采集的咖啡豆样品呈现出明显的分离趋势，表明组间存在明显差异。这些结果再次证实，烘焙过程引起了咖啡豆脂质组学的较大变化，并且烘焙程度的差异可能使咖啡豆的脂质组成产生差异。

Fig. 6. The score plots of orthogonal partial least squares discrimination analysis (OPLS-DA) pairwise comparisons of different groups of coffee bean. (A) 0 min vs. 4 min; (B) 4 min vs. 8 min; (C) 8 min vs. 12 min; (D) 12 min vs. 16 min.

3.6 筛选烘焙过程中显着不同的脂质

OPLS-DA模型已被证实对于进一步筛选差异脂质是有意义且稳定的，四个对照组的脂质下调和脂质上调的结果如Fig. 7所示。在0~4min的烘焙过程中，16种脂质发生变化，其中7种上调，9种下调，这表明咖啡豆脂质谱在烘焙开始时发生了变化。烘焙4~8 min时筛选出的差异脂质为7个，烘焙8~12 min时筛选出的差异脂质为10个。显着的脂质变化发生在烘焙的后期阶段，在12~16 min过程中总共有19种脂质发生变化(11种上调，7种下调)。

Fig. 7. Upregulated and downregulated differential lipids in pairwise comparison. Red indicates an upward adjustment and green indicates a downward adjustment. (A) 0 min vs. 4 min; (B) 4 min vs. 8 min; (C) 8 min vs. 12 min; (D) 12 min vs. 16 min.

● 4. 总结 ●

在这项研究中，采用脂质组学方法来研究和比较不同烘焙时间的咖啡豆的脂质。总共鉴定并量化了 12 种脂质类别和105 种脂质分子种类。在所有分析的脂质中，TAG是不同烘焙程度的咖啡豆中最丰富的脂质。此外，它们还富含磷脂。烘焙咖啡豆的过程涉及一系列复杂的化学反应，这些反应显着影响咖啡的最终质量。我们的结果揭示了咖啡豆在烘焙过程中脂质成分的动态变化。烘焙开始时磷脂含量增加可能是由于细胞膜损伤造成的，而烘焙结束时磷脂含量水平下降可能是由于热降解造成的。而甘油酯在烘焙过程中水解导致其含量下降，而后期其含量增加的机制仍需进一步研究。值得注意的是，烘焙的早期(0-4 min)和后期(12-16 min)阶段对于咖啡豆烘焙过程中脂质成分的转变至关重要。