【qPCR的"有料"秘笈】从此qPCR程序设置不求人

影响延伸的因素

PCR产物长度：一般qPCR扩增产物长度控制在200 bp（即0.2 kb）以内，不同Taq聚合酶扩增速度有所差异，因而最终延伸时间不同（FP217采用的Taq酶延伸速度可达1 kb/min，因此，使用FP217只需15 sec即可完成扩增）。

定量仪器性能影响：不同仪器采集荧光信号时间不同，如ABI 7000/7300需要设置为31 sec而ABI 7500需设定在32 sec（FP217兼容普通和快速定量仪器）。

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结果重复性不好

1. 加样不准确，移液器需要定期校准，并选择品质有保证的耗材。

2. 反应体系未能充分混匀。建议以Mix预混后进行分装。

3. 模板浓度低。可适当调整样本（如cDNA）的稀释倍数。

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熔解曲线不是单一峰

说明存在非特异性扩增，需判断是哪种情况：

1. 可通过Tm值判断是否存在引物二聚体（一般引物二聚体的Tm值远小于目的产物的Tm值，miRNA须另作分析），此时建议适当减少体系里的引物量。如果还是不能解决，请重新设计引物。

2. 模板有基因组污染时，也可能产生非特异性扩增。RNA提取时应避免基因组DNA的残留（推荐使用去基因组反转录试剂KR116/KR118），设计引物时可通过设计跨内含子引物来避免基因组扩增影响。

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熔解曲线是单一峰

但存在其他问题

1. 峰型不对称

   可能存在不同片段大小的非特异性扩增，且非特异性扩增的产物量较少。可使用三步法扩增，寻找合适退火温度，改善峰型不对称的结果。

2. Tm值低

   Tm值受扩增产物和试剂成分等影响，如果扩增目的基因为短片段（如miRNA），Tm值会偏低。如果是长片段，Tm值偏低可能是引物二聚体造成的。可通过一代测序对qPCR产物进行检测，明确产物是否为目的片段。

• 反应快速：热启动时间短, 酶活性高

• 扩增能力：优化的PCR Buffer体系, 保证试剂的高扩增效率和产物的特异性

• 透明管：光稳定性好，透明管包装更方便客户取用

• 仪器适用广泛：兼容普通和快速定量仪器

以玉米基因NK603构建的质粒为模板，进行6个10倍梯度（ 4.8×10²- 4.8×10⁷  copies/μl）稀释，在TGreat Real 96上使用FP217进行定量分析。

FP217在宽广的模板量区间内均具有良好扩增曲线和线性关系，定量结果优异。