Cell子刊 | LiP-MS技术揭示蛋白质结构变化如何影响衰老

研究者使用了磁活化亲和纯化技术，获取了年轻和衰老的酿酒酵母细胞组分，并通过LiP-MS技术比较了它们之间的蛋白质结构状态，结果显示，468种蛋白质（1272个肽段）发生了结构变化，年龄相关结构变化的蛋白质表现出更复杂的蛋白质-蛋白质相互作用和更多的代谢调节因子、翻译、蛋白质折叠和氧化应激反应相关的GO术语。与已知影响长寿的基因进行比较，年龄相关结构变化的蛋白质含有更多抑制长寿基因，并且这些蛋白质主要富集于细胞质翻译和代谢过程，包括糖酵解和ATP生成。大多数年龄变化的蛋白质位于细胞质、线粒体和细胞核，这些过程都与衰老相关。

年龄相关的结构变化揭示了蛋白质在衰老过程中的功能。热休克蛋白（Hsp）家族的多个成员，包括Hsp40、Hsp70、Hsp90、Hsp100、Hsp110和TRiC蛋白，在衰老细胞中经历了显著的结构变化。特别是Hsp70同工型Ssa1的可用性受到影响，而其功能下降与结构变化的关系尚未完全理解。Ssa1中的结构变化主要发生在核苷酸结合结构域（NBD）和底物结合结构域（SBD）等活性依赖的区域，这与Hsp70的变构周期密切相关。此外，老化细胞中SBD区域内的胰蛋白酶肽段丰度增加，表明在老化过程中该区域对蛋白质水解酶的裁剪作用减弱。类似的结构变化还出现在与核糖体相关的Hsp70蛋白Ssb1和Ssb2以及内质网中的Kar2/BiP蛋白的SBD区域，这表明老化可能导致Hsp70在细胞质和内质网中参与新生蛋白质折叠的客体占用率增加。此外，衰老细胞中还观察到参与蛋白质翻译和tRNA氨酰化调控的蛋白质的富集，包括一些tRNA修饰酶。其中，Trm1在tRNA中的位置G26上催化N2,N2-二甲基鸟苷（m2,2G）修饰，在老化细胞中经历了结构变化。老化细胞中m2,2G的丰度增加与Trm1活性位点的增加一致。因此，通过LiP-MS技术可以揭示蛋白质活性中微妙的与年龄相关的变化。

氨基酸代谢酶是一种在年轻和老化细胞中过度表达的蛋白质类型。荧光显微镜观察显示，大多数酶没有显示出与年龄相关的变化。然而，谷氨酸合成酶Glt1在老化细胞中的定位发生了明显的变化，形成了大型的聚合物结构。这些聚合物以弥散的形式在细胞分裂时传递给子细胞。Glt1聚合物的形成受到氨基酸可用性的影响，而不受限制葡萄糖或氮的影响。特别是谷氨酸和天冬氨酸可以抑制Glt1的聚合物化。此外，细胞质pH的下降可能也促进Glt1的聚合物化。有趣的是，作者还观察到老化细胞中的Glt1聚合物可以被逆转。总体而言，这些结果表明Glt1聚合物的形成受到细胞内谷氨酸水平和pH的调节。

为了理解Glt1结构的性质，使用光镜-电镜关联成像技术（CLEM）对其进行检查。电镜照片显示Glt1聚合物呈成束丝状结构，暗示其可能在聚合物端部进行组装。通过活细胞成像实验，追踪携带GFP或mKate2标记的Glt1的交配酵母细胞融合，发现两个聚合物以稳定方式在远端结合，证明Glt1聚合物可以通过新增亚基在尖端生长。测量个别细胞内数小时的聚合物生长，对76条聚合物生长轨迹进行拟合，揭示了双相生长曲线。初始24分钟内，聚合物快速生长阶段的延长倍增时间为7.9分钟，随后进入慢22倍的生长阶段。总之，数据表明Glt1在芽酵母细胞早期衰老期间经历了从扩散到纤维状聚合物的快速开关式转变。

一些代谢酶会根据环境变化进行可逆聚合，作为对环境变化的适应反应。作者研究了老化相关的Glt1聚合对细胞寿命的影响。通过比较野生型和表达不聚合的GLT1-MUT的细胞的复制寿命，发现GLT1-MUT细胞的寿命中位数比野生型细胞延长了20%（p<0.05）。作者进一步使用RNA测序和代谢分析发现，Glt1聚合状态与氨基酸代谢紧密相关，并且老化细胞中氨基酸水平的增加可能与Glt1聚合介导的氨基酸摄取有关。此外，还发现Glt1聚合状态可能导致其他氨基酸的积累，特别是苯丙氨酸。并且还观察到，老化细胞中线粒体功能下降与细胞质内氨基酸的过量有关，而Glt1聚合似乎加剧了这种影响。然而，Glt1聚合并不依赖于线粒体功能障碍，而不发生聚合可以抵消衰老细胞中的线粒体功能障碍。最后作者发现Glt1聚合通过提高细胞内氨基酸水平可能危及线粒体膜电位。

该研究利用限制性酶解-质谱分析（LiP-MS）技术对酵母与年龄相关的蛋白质结构变化进行了全蛋白组分析，结果显示与年龄相关的功能变化包括调节翻译、蛋白质折叠和氨基酸代谢。具体来说，Glt1谷氨酸合成酶在老化过程中会聚合成超分子自组装体，导致细胞内氨基酸稳态破坏。通过突变聚合界面成功恢复了老化细胞的氨基酸水平，减轻了线粒体功能障碍，并延长了寿命。这项研究为深入了解与年龄相关的表型提供了重要线索，并为逆转这些表型提供了新机会。