炙热的双抗纯化，如何高效去除错配体、聚体、半抗等杂质？毫厘SpreX系列轻松搞定！

PART 1：双抗简介

双特异性抗体（bsAb）是含有两种抗原结合位点的基因工程抗体，能在靶细胞和功能细胞之间架起桥梁，产生特异性的效应功能，在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有十分广阔的应用。通过双特异性抗体介导细胞毒作用杀死肿瘤细胞是当前免疫治疗应用研究的热点，其主要特征是双特异性抗体能同时结合肿瘤细胞表面特定的抗原和免疫效应细胞上的靶抗原，直接激发免疫效应细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤作用。然而，在双特异性抗体药物研发过程中，普遍存在着表达困难、产量低、纯化步骤繁琐、稳定性差等障碍。

PART 2：双抗工艺开发

抗体行业有一句话“单抗看工艺，双抗看平台”，充分体现了在双抗工艺中上游分子构建过程的重要性。目前国外的各大制药公司针对双抗的开发都建立了各自的技术平台，如罗氏公司的“2+1”双抗平台、安进公司通过收购Micromet 公司而获得的BiTE平台、强生公司旗下的DuoBody 技术平台等。通过药物分子前期合理的构建能够显著影响其成药性和稳定性，而对纯化阶段来说则可以通过一定的结构改造减少分子的错配，降低纯化工艺开发的难度。

PART 3：双抗纯化

双抗从结构上看与单抗最大的区别是可以有两个不同的Fab和Fc结构域，使得抗体分子的两条重链和两条轻链各不相同，进而产生与单抗纯化过程中不同的产品相关杂质——错配体。

双抗分子根据其是否含有Fc片段将其分为IgG-like型双特异性抗体以及non-IgG like型双特异性抗体。含有Fc片段的IgG-like型双特异性抗体不仅能够发挥ADCC和CDC效应，而且其体内半衰期更长、溶解性和稳定性也会更好；而不含Fc片段的non-IgG like型双特异性抗体由于分子量小，具有穿透性更强、免疫原性低的优点。此外lgG-like 双特异性抗体还可根据左右是否对称分为对称型和非对称型。双特异性抗体常见的结构主要有以下几种形式：

亲和层析作为抗体纯化的“金方法”，在双抗纯化中也应优先考虑。IgG-like型双特异型抗体由于具有Fc片段，使用ProA亲和层析进行捕获即可。non-IgG like型双特异性抗体不具有Fc片段，可以根据其轻链类型是Kappa轻链还是Lambda轻链选择能够结合相应轻链的亲和层析填料进捕获。

在双抗的亲和层析阶段中，其主要的杂质包括工艺相关杂质（HCP、DNA、Protein A等）和产品相关杂质（聚体（aggregate）、错配体（homodimer）、半抗（Half antibody ）、抗体片段等）。与单抗的亲和层析粗纯阶段不同的是 ，双抗的亲和层析阶段对产品相关杂质的去除有了更高的要求。

由于错配体、半抗等在药效和生物学活性上与正确结构的双抗分子差别很大，甚至可能有药物安全性上的风险所以必须去除，两者在化学性质上两者又十分接近，所以通常会在项目前期对分子进行改造来减少错配体的形成或是通过亲和层析进行去除。比较常见的改造方式有以下几种：

杵 - 臼结构双抗是将一个抗体的重链 CH3 区366 位体积较小的苏氨酸残基突变为体积较大的酪氨酸，形成突出的“杵”型结构 ；将另一个抗体重链 CH3 区 407 位较大的酪氨酸残基突变成较小的苏氨酸，形成凹陷的“臼”型结构 ，利用杵- 臼结构形成的空间位阻效应能够显著减少错配体的形成。

通常在合成工艺中，会尽可能控制臼 - 重链过表达，造成主要的副产物为臼 - 半抗和臼 - 臼同源二聚体。在低 pH条件下，臼 - 臼同源二聚体的稳定性比杵 - 臼结构双抗差，构象易发生转变、更疏水。因此，在下游纯化时，先试用SpreX ProA D80/H60对样品进行粗纯后，使用SpreX MMC层析介质可高效地分离臼 - 臼同源二聚体与杵 - 臼结构双抗。

静电转向结构双抗是在一条重链的 CH3 区使荷正电的氨基酸突变，在另外一条链上使荷负电的氨基酸突变，通过静电相互作用阻碍同源二聚体的形成，促进目标双抗的形成。

上游可通过控制 2 条重链的表达比例为1：1来避免同源二聚体的形成 ；下游纯化可通过使用SpreX ProA D80/H60填料进行亲和捕获，由于同源二聚体与异源二聚体在电荷性质上有差异，捕获的蛋白中间体可再通过阳离子交换填料SpreX S D30进行精纯。

将抗体其中一条重链的CH3片段中能够与ProteinA特异性结合的区域进行改造，使其丧失与ProteinA结合的能力，改造后的片段称为Fc*，双抗合成时可形成 FC*×FC*、FC×FC*、FC×FC 3 种二聚体。根据三种二聚体与ProteinA结合能力的不同使用SpreX ProA D80/H60即可将其分离。然后再使用SpreX MMC进行精纯去除过程相关杂质。

有研究表明，在亲和层析阶段利用半抗和完整抗体与亲和配基结合能力的不同，通过pH梯度洗脱能够将其分离，在洗脱液中加入500mM NaCl或300mM CaCl2能够增强其分辨率。此外，带有Fc片段通常会导致抗体分子聚集，对称性的IgG like型双特异性抗体的聚集倾向更强，这是因为更长的肽链提高了肽链的灵活度，使分子间的相互缠绕更容易发生。在洗脱液中添加PEG能够显著提高聚体的去除效果。当然，即使在亲和层析阶段不使用这些额外的手段去除聚体，在后续中纯和精纯阶段的离子层析、疏水层析和复合模式层析也能够满足聚体去除效果的要求。

出于病毒安全性的考虑，在上述层析过程中还可以加入阴离子流穿模式层析，不仅去除病毒，还可以进一步降低HCP和DNA等杂质的含量。

由于不具有Fc片段，non-IgG like型双特异性抗体无法通过传统的ProA亲和层析进行纯化，此时通常的做法是根据蛋白轻链类型选择能够与之特异性结合的亲和层析填料，但往往这类层析介质价格昂贵。有研究显示可以尝试在双抗分子上添加His标签后进行镍离子亲和层析实现样品捕获^[4][5]，据此毫厘科技推荐在捕获阶段使用SpreX Ni Elite/MAX两款镍离子层析介质，随后再根据蛋白本身性质选择SpreX S D30或是SpreX MMC进行精纯，并推荐进行一次阴离子层析，去除HCP和DNA的同时还能大幅降低病毒含量。

PART 4：总结

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