背景：

空间解析转录组学（SrT）是一项前沿技术,使科学家能够测量组织样本中所有基因的活动并绘制出基因活动发生的位置图。

挑战：

迄今为止,现有方法的使用成本过高,限制了创新型研究机构的使用。

解决方案：

本文介绍了一种利用 sciFLEXARRAYER S3 微量点样仪制造分子双条码 DNA 阵列的低成本策略。该策略已成功应用于人脑器官组织的大规模 SrT 研究,从而实现了这种复杂组织的三维分子图。

由于目前技术的高昂成本,许多新的生物研究领域还无法为科研机构所接触。例如,由于仪器和试剂费用高昂,尤其是需要大量独特的DNA探针,大规模生产SrT制造面临挑战。

在这个案例研究中,我们提出了一种改进且成本更低的策略,用于制造基于sciFLEXARRAYER S3皮升微量点样仪的分子条形码DNA阵列。这种方法不是只使用一个分子条形码标记每个区域,而是结合了两个带有x和y坐标的分子条形码的探针。为了在阵列上最有效地分布双条形码DNA探针,我们使用了sciFLEXARRAYER S3皮升级点样仪。通过这种方法,我们实现了大规模的空间解析转录组学研究,并通过分析人类脑器官连续切片,验证了这一结果,从而产生了三维分子组织重建。

这种方法的详细描述可以在Lozachmeur等人的2023²文章中找到。

材料与方法:

在本应用说明中,介绍了使用精密点样仪  sciFLEXARRAYER S3沉积DNA探针的方法,这是制造SrT双条形多 T-DNA阵列的整体方法的一部分。整个工作流程的方法细节可以在Lozachmeur等人的2023²年的文章中找到。

图1:用于空间分辨转录组学（SrT）的双条编码 DNA 阵列的制造方法。（A）使用sciFLEXARRAYER S3微量点样仪来打印双条形码DNA阵列。（B）基于两种携带不同分子条形码的寡核苷酸沉积的DNA阵列打印策略（每行：BCri；每列：BCci）。两种寡核苷酸共享一个互补序列（Gibson）。BCri寡核苷酸的5''端含有氨基C6连接修饰,其后是4个“S”（胞嘧啶或鸟嘌呤）核苷酸,用于UV交联。一旦BCcj引物沉积在打印的BCri寡核苷酸之上,玻璃载玻片会被紫外线照射以进行共价交联,然后通过它们的互补Gibson区域进行探针延长。这个延长过程（T4 DNA聚合酶）产生一个由T7启动子(T7p),两个独特的分子标识符(UMIs),两个分子条形码夹着互补的Gibson序列,以及一个poly(T)组成的长探针。（C）显微照片描绘了一个由32×32个以间隙方式打印的斑点组成的DNA阵列的一部分,导致有2,048个不同的探针的密度。

图片取自图1,Lozachmeur, Gwendoline等人,并进行了改编。

制造双条编码聚T-DNA阵列

使用sciFLEXARRAYER S3进行精密点样

sciFLEXARRAYER S3 是一款自动化的压电驱动、非接触式微量点样系统,专为学术界和研发实验室设计的经济型入门设备。它包含压电喷点毛细管（图 2A),用于吸入和喷点皮升量级的液体,适用于生产微型 DNA、蛋白质和聚糖阵列、细胞转染阵列,以及装载 MALDI-MS靶标或生物传感器表面。

结果与讨论

采用先前介绍的方法,我们制造出了由 2048 个不同探针组成的用于空间转录组学的大规模 DNA 阵列。由于 sciFLEXARRAYER S3 精密微量点样仪的独特功能,这种大量探针（部分相互叠加）的精确沉积成为可能。利用这种技术,可以在目标表面打印出超低体积的DNA探针，在本研究中,每个探针的体积为250pL。该点样仪还可以沿x和y 点样轴精确喷点,点与点之间的距离最小,从而最有效地将探针覆盖在目标玻璃载玻片上(图1G)。由于sciFLEXARRAYER S3 在超低体积沉积方面具有很高的精确度,因此非常适合小型化检测和在定制目标上进行喷点。

由于配备了双高分辨率摄像头(图2,水平液滴摄像头和垂直摄像头),sciFLEXARRAYER系统可以完全控制液滴的生成和目标定位，从而验证喷点输出的质量。通过水平液滴摄像头，可以监测液滴的生成、液滴体积、质量以及与打印轴的偏差,显示出稳定的皮升级液滴（图2B）。在喷点过程结束时,垂直摄像头可对目标进行检测,发现质量控制不合格的点,如融合点（图2C）。

使用的探针数量大大减少，可显著节约成本

由于采用了两个独立条形码的组合沉积法,制造一个由2048个独特分子组成的网格只需要96个独特的寡核苷酸。考虑到一个合成寡核苷酸的成本约为60欧元，覆盖这些试剂总计需要约6000欧元；而如果购买2048个独特的寡核苷酸可能需要超过120000欧元;也就是说，成本可节省约20倍。

图2.使用微量点样仪sciFLEXARRAYER S3 (SCIENION)。打印探针与图1有关 (A) Genoscope 的sciFLEXARRAYER S3 仪器的概览照片。箭头和数字表示：(i) 压电喷点毛细管；(ii) 垂直摄像头,用于在喷点后对玻璃载玻片成像；(iii) 液滴高分辨率摄像头,用于观察和量化液滴参数；(iv) 固定玻璃载玻片的真空床；(v) 96 孔板的位置,其中装有待喷点的DNA探针；(vi) 电脑屏幕,其中装有控制 sciFLEXARRAYER S3 微量点样仪的软件。屏幕上显示的是高分辨率照相机拍摄的液滴图像。(B) 液滴生成控制。通过高分辨率水平液滴摄像机拍摄的图像,可以看到针尖以及喷射出的液滴。通过 ROI（感兴趣区域）可以量化中心轴的偏差、液滴体积以及针尖与液滴位置之间的距离。(C) 使用相机对目标表面进行液滴分配控制。上图：先在水平轴上放置带有分子条形码的探针,然后再放置与垂直轴相关的探针。下图:打印载玻片的示例,首先在水平轴上喷点（左图),然后在垂直轴上喷点（右图)。请注意,在第二次喷点输出中可以看到两个融合的液滴。作为生产过程的一部分,所有打印的玻璃载玻片都要以这种方式进行评估，以评估潜在的熔合误差,并在出现重大问题时丢弃玻璃载玻片。

图摘自 S1，Lozachmeur、Gwendoline 等人，经改编。

这项研究提出了一种策略,使得之前因为检测的高成本而无法接触SrT的研究人员能够触及到它。通过使用更少的探针并将它们有效地分配到目标上,科学家们可以执行以前成本过高的分子生物学策略。

参考文献

1.Ståhl,P.L.,Salmén,F., Vickovic, S., Lundmark, A., Navarro, J. F., Magnusson, J., ... & Frisén, J. (2016). Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science, 353(6294), 78-82.

2.Lozachmeur, G., Bramoulle, A., Aubert, A., Stüder, F., Moehlin, J., Madrange, L., ... & Mendoza-Parra,M.A.(2023).Three dimensional molecular cartography of human cerebral organoids revealed by double-barcoded spatial transcriptomics. Cell Reports Methods, 3(9).

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