行业资讯 | ICH Q5A（R2）新变化重点解读抢先看（2）

引言

本期文章为 #微谱药研院 x V·BSC微谱生物安全研究平台 推出的“ICH Q5A（R2）新版本重点详解”系列第二篇。

上期，围绕文件第一、二章，我们对比解读出 ICH Q5A（R2）中的两处较大变化：生物技术产品范围延伸至病毒载体类产品；病毒污染物范围扩大，外源病毒引重视。本期，我们将围绕第三章《细胞系检定：病毒检测》进行详细对比解读，此章节新增内容比重大、增改要点密度高，欢迎您留言与我们互动探讨。

ICH Q5A（R2）新变化重点解读抢先看（1）

变动详情

01

「分子生物学方法」纳入病毒检测推荐方法

下一代测序技术（NGS）细则明确

详解 #3

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对于主库中的病毒检测，除了（R1）版中给出的检测方法外，（R2）版更新了常见病毒检测方法的表（R1表2），增加了NGS，文中明确提出该方法“可用于补充或替代基于体外细胞培养试验和体内动物试验”，并重点说明了其中的下一代测序技术（NGS）和核酸扩增技术（NAT），可能分别适用于广谱和特定病毒检测。采用此类试验时，无需将其与当前推荐的体外和体内检测方法进行系统的头对头比较。由于检测方法的灵敏度和病毒检测的广度，NGS也可用作基于细胞的感染性试验的替代方法，以解决潜在的检测局限性，或用于检测试验系统中无可见表型的病毒。

（R1）版：逆转录病毒测试、体外检测、体内检测、抗体产生试验

（R2）版：逆转录病毒测试、体外检测、体内检测、抗体产生试验、分子生物学方法（核酸扩增技术、下一代测序）

在（R2）版本中，对病毒检测和鉴别方法的建议部分，反复提倡鼓励使用NGS等方法替代体内检测方法，这是Q5A协调指导原则此次更新的重要变化部分，也是文件改动、增补比重最大的部分之一。

原文如下：

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3.2 对病毒检测和鉴别方法的建议（相关重点节选）

下一代测序（Next Generation Sequencing，NGS）技术和核酸扩增技术（Nucleic Acid Amplification Techniques，NAT），如聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）可能分别适用于广谱和特定病毒检测。采用此类试验时，无需将其与当前推荐的体外和体内检测方法进行系统的头对头比较。特别是，不建议对体内检测方法进行头对头比较，以满足替代、减少、和优化动物使用的全球目标。由于检测方法的灵敏度和病毒检测的广度，NGS也可用作基于细胞的感染性试验的替代方法，以解决潜在的检测局限性，或用于检测试验系统中无可见表型的病毒。对阳性结果应进行研究，以确定检测到的核酸是否与感染性病毒相关。

以下是针对制造商应使用的一般框架的简要描述，用以开发一个全面的针对产品和生产工艺特定（或适当）的病毒检测方案。检测计划或策略应随附检测方法的适当理由。

3.2.5 分子生物学方法

分子生物学方法可用于补充或替代基于体外细胞培养试验和体内动物试验。

3.2.5.1 核酸扩增技术

核酸扩增技术（NAT），如基于PCR的方法，通常单独使用或以多重形式使用，以检测已知病毒或已知密切相关病毒家族的病毒序列。靶向NGS方法也可能适用于已知病毒的灵敏检测。这些分子生物学方法可用于补充细胞培养检测法，其中由于检测干扰而存在局限性，并且在此类病毒无法在细胞培养物中轻易生长以进行感染性检测的情况下，其为检测特异性病毒的有效工具。NAT方法还适用于更广谱的病毒检测（例如，简并PCR），然而特异性可能会降低。由于检测的特异性，可能需要进行大量的病毒特异性PCR检测，以检测由单个普遍应用的生物测定法检测到的病毒的广度。应针对NAT检测方法的预期用途进行了适当的鉴定或验证。

3.2.5.2 下一代测序

新的先进分子生物学方法，如NGS（高通量测序），已被证明有能力进行广谱的病毒检测。NGS可以提供确定的病毒检测的灵敏度和广度，并减少动物的使用和缩短检测时间。应提供所用NGS方法的验证材料以支持NGS方法在申请中使用。其包括方法验证以及检测方法或基质特异性鉴定（如适用）。基于潜在的安全问题，生物信息学分析可以针对特异性病毒或未知病毒进行广谱的病毒检测。NGS可替代体内试验进行广谱的病毒检测，用于检测未知或非预期的病毒种类。NGS也可以补充或替代体外细胞培养试验，用于检测已知、未知或非预期的病毒种类。此外，该检测法还可用于检测已知病毒，并替代HAP、MAP和RAP试验以及其他病毒特异性PCR检测法。

对于细胞基质和细胞库的表征或检测、已知和未知病毒的检测，以及由于载体病毒（见附件7）缺乏有效中和或由于产品或各培养基组分引起的毒性而存在测定干扰的病毒种子或收获物的情况下，应考虑使用NGS。在这类应用中，NGS可用于检测存在于细胞DNA中的病毒序列（基因组学）或在细胞中以RNA表达的病毒序列（转录组学），以及用于检测存在于病毒颗粒中的病毒基因组（病毒学）。应提供选择这些不同策略的依据。

应用NGS对已知病毒进行灵敏检测和/或对新型病毒进行广谱检测时，申请人应考虑NGS工作流程中的几个关键步骤。这些步骤包括：1）基于样本材料类型的样本处理（检测时）和加工；2）高效的病毒核酸提取（包括包膜和非包膜颗粒）和文库制备；3）选择合适的测序平台，以及4）针对多样性数据库（具有不同病毒家族的病毒序列）进行全面的生物信息学分析。样本处理和加工期间执行的所有步骤的目的在于最大限度地进行病毒检测。

应使用合适的标准品或参照品进行分析鉴定和验证，以评估方法中所涉及不同步骤的性能，并证明病毒检测的灵敏度、特异性和广度。这可能包括使用目前可用的具有不同物理（大小、有包膜和无包膜）、化学抗性（低、中和高）和基因组（DNA、RNA，双链和单链、线性、环状）特征的病毒试剂标准品，以评估整个NGS工作流程或特定步骤的性能，应使用具有不同病毒序列的综合病毒数据库进行 广谱的病毒检测。此外，其他标准品类型可用于评估特定技术和生物信息学步骤。由于NGS的工作流程复杂，我们鼓励制造商与相应的监管机构就方法验证和数据提交相关期望进行讨论。

另外，3.2.3节-体内检测 中提到，“基于NGS进行病毒检测的广度，及其对替代、减少和优化动物试验使用的全球目标的促进作用，因此鼓励使用NGS替代体内检测。采用NGS替代体内检测时可能需要提供相关验证研究数据包以作为支撑。”

3.2.4节-抗体产生试验 中提到，“病毒特异性PCR或靶向分子生物学方法可用作表3中所述动物试验的替代检测方法。”

对内源病毒和外源病毒的检测方法有很多，（R2）版中新增了全面测定策略应该考虑要点：细胞系来源；传代历史；在细胞系生成、细胞库制备及生产过程中使用的生产用原材料和试剂。该策略还应包括根据对细胞基质、原材料和所用试剂的风险评估进行适当的其他检测。例如，如果存在特异性病毒的可能性相对较高，除非另有说明，否则应包括针对该病毒的特定检测或其他方法。应设相应的对照试验，以证明试验具有充分的敏感性和特异性。

02

「逆转录病毒检测」要点细化

详解 #4

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沿袭自（R1）版的检测方法——「逆转录病毒检测」部分，在（R2）版中也有大篇幅的增补，详细规定逆转录酶检测的要点，并阐明以下两种情况下应做的检测：

未知逆转录病毒信息细胞系——对细胞进行电镜检测；上清进行逆转录酶活性测定（PERT）。

逆转录病毒阳性细胞——无需进行逆转录酶活性测定，但需要通过电镜检测确定逆转录病毒的类型（A型或C型），并选择合适的细胞进行感染性检测。

这一部分同时也对（R1）版一笔带过的「化学诱导法」进行了补充阐述，肯定了其价值。

原文如下：

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3.2.1 逆转录病毒检测

应对MCB和用于生产的达到或超过LIVCA的细胞进行逆转录病毒检测。这些检测包括通过直接接种或共培养进行的感染性测定、逆转录酶（Reverse Transcriptase，RT）活性测定和通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）对颗粒进行评价。

如果不知道细胞系是否产生逆转录病毒颗粒，则应对细胞进行TEM检测，并对澄清的上清液进行基于PCR的RT测定（如产物增强型RT测定法）。基于PCR的RT测定法极具应用价值，原因在于其可以检测所有逆转录病毒的RT活性；然而，RT活性可能与感染性或非感染性逆转录病毒有关。由于一些细胞DNA聚合酶可发生交叉反应并导致阳性RT结果，应在确认RT活性（由于逆转录病毒污染）或阳性TEM结果后进行试验，以在认可有效的细胞中对感染性逆转录病毒进行检测，包括采用读出灵敏测定法对人体细胞系进行逆转录病毒检测。

如果已知细胞系能结构性产生逆转录病毒颗粒（如来源于啮齿类动物、昆虫和鸟类细胞系），则预期会存在RT活性，因此可能不需要应用基于PCR的RT测定法。应进行TEM检测以检查存在的逆转录病毒颗粒的类型（如A型和C型），并使用相关的认可有效的细胞（如用于啮齿类动物逆转录病毒的杜氏小家鼠细胞和SC-1（小鼠胚胎细胞）），采用用于逆转录病毒检测的读出灵敏测定法（如产物增强型逆转录酶活性（RT）测定法，肉瘤-阳性、白血病-阴性（S+L-）测定法，或XC空斑试验或广义分子检测）进行感染性检测，以确定内源性逆转录病毒颗粒是否具有感染性。

判读逆转录病毒检测结果时应将所有可用数据纳入考量。基于第3.3节和第5节中讨论的风险评价，表达内源性逆转录病毒颗粒的细胞系或可应用于生产。

尚未发现转导研究在已充分表征内源性逆转录病毒（例如中国仓鼠卵巢（CHO）、NS0和Sp2/0）的细胞系中的应用价值。然而，此类研究可能有助于对新细胞基质是否存在未知的内源性逆转录病毒进行评价。此外，基于风险评估，对潜伏性DNA病毒（例如，人类细胞中的疱疹病毒）和潜伏性RNA病毒（例如，昆虫细胞中的诺达病毒）进行转导研究也可能是适当的。这些研究可能有助于为来源于新细胞基质的产品提供病毒检测和清除策略。

03结语

关于病毒检测方法，在（R1）版推荐方法的基础上，（R2）版强化突出了“全面测定策略”这一主张，并加入了【分子生物学方法】，对原版各方法阐释的未尽之处进行了详实的补充修订，后文中对加工工艺要点同样做了细化规定，详情如何，敬请关注“ICH Q5A（R2）新版本重点详解”系列之（三）。

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