Dr.赛流式小课堂 | 荧光减一对照(FMO controls)

在流式分析实验中，对照组的设置非常重要。合适的对照组，能够更准确地帮助我们对实验数据进行圈门。提到对照，我们首先会想到空白对照、阴性对照、阳性对照、单染对照及同型对照，但是很多人会忽略掉FMO。那么什么是FMO呢？FMO通常是指，使用扣除了一个颜色的所有染色组合来标记样品的对照。在扣除一个颜色后，我们可以直观看到其他荧光基团在扣除颜色的通道上的溢漏，从而能更准确地设置圈门位置。

为了更好地理解FMO的意义，我们一起来看图1的示例。在图1的实验中，我们取了小鼠脾脏，对其中的调节性T（Treg）细胞进行流式分析。若我们以空白组（图1.a）来圈定FOXP3的阳性细胞群，会导致实验组（图1.c）中FOXP3阳性细胞群的比例偏高，因此以FOXP3-FMO（图1.b）来圈门更为合适。

图1*. Treg细胞染色。用CD4-FITC、CD25-APC、FOXP3-PE染色Treg细胞，用空白管圈门会导致FOXP3阳性细胞群偏多，用FOXP3-FMO的信号圈门数据更加准确。

流式配色时需要注意表达丰度低的抗原搭配荧光强的基团。对于表达丰度低或连续表达的抗原，除了选择荧光强的基团外，设置FMO也很有必要。

以Treg细胞染色为例，如图2，首先会用到空白对照，来调节细胞FSC和SSC的电压。随后为了调节各个荧光通道的电压及相互间的补偿，会使用各自的单染对照。当抗原的表达丰度低或连续表达时，我们也会设置同型对照来排除抗体非特异性结合造成的假阳性信号。在多色染色中，由于荧光较多，可能存在某个荧光对目的荧光通道的溢漏。因此对于一些表达丰度低或连续表达的抗原进行多色分析时，可以设置FMO来有效排除由于离散误差造成的背景对结果的影响，能帮助更好地圈门，准确区分阳性细胞群。正如图1中表达丰度低的FOXP3，若是不设置FMO，很难准确区分阳性细胞群的位置。

图2.Treg细胞染色组别设置。空白对照调节FSC及SSC，单染对照调节补偿，同型对照排除非特异性染色，结合FMO对表达丰度低的FOXP3进行圈门。

前面提到，FMO是指使用扣除了一个颜色的所有染色组合来标记样品的对照。那么在染色过程中，根据抗原表达情况，我们需要针对若干个表达丰度低或连续表达的抗原，分别单独设置FMO。在减去该靶标抗体的同时，会用其对应同型对照的抗体补上该通道。

我们一起来看图3的例子。取小鼠脾脏单细胞悬液，通过流式多色染色，来检测经刺激后T细胞中IFN-γ，TNF-α和IL-17A等细胞因子的表达情况。对于表达丰度高的CD3，CD4和CD8等靶标，可以无需FMO辅助圈门；由于IFN-γ和 IL-17A的表达丰度低，TNF-α连续表达，需要分别设置针对这三个靶标的FMO。

*以上数据均出自赛默飞流式细胞术精品培训班，所用流式细胞仪为Attune™ NxT流式细胞仪。

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