2023-11-25 14:56:46, 赛默飞生命科学 赛默飞世尔科技生命科学产品
Dr.赛,我想知道在流式实验中需要设置哪些对照组呢?
除了常规的空白对照、阴性对照和阳性对照外,我们通常还会设置单染对照、同型对照以及FMO对照。
那……什么是FMO对照呢?
FMO的全称是Fluorescence minus one,意思是流式Panel中的所有荧光抗体减去单个荧光抗体后染色细胞样本。
所有的抗原都需要设置FMO对照吗?
通常对于表达丰度低或连续表达的抗原,才有必要设置FMO。
在使用单染对照调节好合适的补偿后,我们要对流式数据进行圈门分析,还依赖荧光减一对照(Fluorescence minus one,FMO)这种对照组。这节课跟随着Dr.赛一起来探究FMO对流式实验数据分析的帮助有多大。
01
什么是FMO?
在流式分析实验中,对照组的设置非常重要。合适的对照组,能够更准确地帮助我们对实验数据进行圈门。提到对照,我们首先会想到空白对照、阴性对照、阳性对照、单染对照及同型对照,但是很多人会忽略掉FMO。那么什么是FMO呢?FMO通常是指,使用扣除了一个颜色的所有染色组合来标记样品的对照。在扣除一个颜色后,我们可以直观看到其他荧光基团在扣除颜色的通道上的溢漏,从而能更准确地设置圈门位置。
为了更好地理解FMO的意义,我们一起来看图1的示例。在图1的实验中,我们取了小鼠脾脏,对其中的调节性T(Treg)细胞进行流式分析。若我们以空白组(图1.a)来圈定FOXP3的阳性细胞群,会导致实验组(图1.c)中FOXP3阳性细胞群的比例偏高,因此以FOXP3-FMO(图1.b)来圈门更为合适。
图1*. Treg细胞染色。用CD4-FITC、CD25-APC、FOXP3-PE染色Treg细胞,用空白管圈门会导致FOXP3阳性细胞群偏多,用FOXP3-FMO的信号圈门数据更加准确。
02
什么时候做FMO呢?
流式配色时需要注意表达丰度低的抗原搭配荧光强的基团。对于表达丰度低或连续表达的抗原,除了选择荧光强的基团外,设置FMO也很有必要。
以Treg细胞染色为例,如图2,首先会用到空白对照,来调节细胞FSC和SSC的电压。随后为了调节各个荧光通道的电压及相互间的补偿,会使用各自的单染对照。当抗原的表达丰度低或连续表达时,我们也会设置同型对照来排除抗体非特异性结合造成的假阳性信号。在多色染色中,由于荧光较多,可能存在某个荧光对目的荧光通道的溢漏。因此对于一些表达丰度低或连续表达的抗原进行多色分析时,可以设置FMO来有效排除由于离散误差造成的背景对结果的影响,能帮助更好地圈门,准确区分阳性细胞群。正如图1中表达丰度低的FOXP3,若是不设置FMO,很难准确区分阳性细胞群的位置。
图2.Treg细胞染色组别设置。空白对照调节FSC及SSC,单染对照调节补偿,同型对照排除非特异性染色,结合FMO对表达丰度低的FOXP3进行圈门。
03
如何操作FMO?
前面提到,FMO是指使用扣除了一个颜色的所有染色组合来标记样品的对照。那么在染色过程中,根据抗原表达情况,我们需要针对若干个表达丰度低或连续表达的抗原,分别单独设置FMO。在减去该靶标抗体的同时,会用其对应同型对照的抗体补上该通道。
我们一起来看图3的例子。取小鼠脾脏单细胞悬液,通过流式多色染色,来检测经刺激后T细胞中IFN-γ,TNF-α和IL-17A等细胞因子的表达情况。对于表达丰度高的CD3,CD4和CD8等靶标,可以无需FMO辅助圈门;由于IFN-γ和 IL-17A的表达丰度低,TNF-α连续表达,需要分别设置针对这三个靶标的FMO。
图3*.T细胞胞内因子染色。根据CD3、CD4、CD8圈出Th细胞及Tc细胞, 通过IFN-γ,TNF-α和IL-17A的FMO,圈定阳性细胞群。
04
Question & Answer
问
所有抗原都需要设置FMO吗?
答
对于低表达丰度或连续表达的抗原,才需要设置FMO。
问
FMO也需要固定破膜吗?
答
如果样本管需要固定破膜等操作,FMO中对应抗体也需要做一样的操作。
*以上数据均出自赛默飞流式细胞术精品培训班,所用流式细胞仪为Attune™ NxT流式细胞仪。
05
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