使用SEC-MALS分析SARS-CoV-2三聚体刺突蛋白

2023-11-22 14:55:35 东曹（上海）生物科技有限公司

SARS-CoV-2病毒包含四种结构蛋白：刺突蛋白(S)、包膜蛋白(N)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)。SARS-CoV-2三聚体刺突复合物是免疫系统的主要靶点。因此，稳定的三聚体刺突蛋白是RNA和病毒载体候选疫苗的首选抗原，而且在诊断应用中，其优异的灵敏度和特异性也使之成为检测SARS-CoV-2抗体的最优选择。

图1 SARS-CoV-2表面的三聚体刺突蛋白

尺寸排阻色谱常用于测定蛋白质的尺寸和纯度，与多角度光散射 (MALS) 联用时，能够同时测定分子量 (MW) 和尺寸 (回转半径或Rg) 。通过光散射测得的真正分子量揭示了蛋白质的聚集状态，了解其寡聚结构。目前来说，刺突蛋白由于其Rg太小，无法使用MALS进行表征。但是最近的技术发展已经能够测定低于10 nm的Rg。

本研究中，我们利用SEC-MALS技术深度表征了三聚体刺突蛋白的几种变体和修饰版本。

分析条件

仪器：UHPLC系统

检测器：示差折光 (RI) 、LenS3 MALS检测器

色谱柱：TSKgel UP-SW Aggregate (4.6 mmI.D.×30 cm, 3 μm)

流动相：100 mM磷酸盐, 100 mM硫酸钠, 150 mM氯化钠 (pH 6.7)

流速：0.35 mL/min

温度：室温

进样量：10 μL

分析结果

刺突蛋白变体的小角度光散射（LALS）和RI色谱图对比

我们对比了SARS-CoV-2刺突蛋白的LALS和RI谱图，发现由于光散射的响应更依赖于分子量，LALS明显更容易检测到微量聚集体。其更高的灵敏度能够更好地表征刺突蛋白的纯度。

图2 SARS-CoV-2刺突蛋白变体的LALS (实线) 和RI (虚线) 洗脱曲线

LALS测定三聚体刺突蛋白变体的分子量分布

无论蛋白聚集体、三聚体和片段/杂质的占比如何，图3中重叠的分子量分布曲线显示这些变体的结构曲线非常接近。主峰的平均分子量约为500 kDa，高于预测值420 kDa，但与SDS-PAGE结果（单体为150～170 kDa）极为匹配。其他文献也报道了类似发现^[1]。

图3 三种S蛋白变体的分子量分布和RI色谱重叠图

三聚体刺突蛋白变体的尺寸分布

虽然分子量分布曲线几乎一致，但其Rg值稍有不同。图4显示三聚体刺突蛋白变体的构象稍有不同。但在聚集状态下其尺寸趋于收敛。所测三聚体蛋白的Rg值为～6和～9 nm，也与文献一致^[2,3]。

图4 Rg分布和RI色谱重叠图

刺突蛋白修饰对其分子量、尺寸和形状的影响

我们比较了野生型WH三聚体刺突蛋白和两个修饰样品之间色谱图和分子量分布（图5）。RI色谱图显示经修饰的三聚体刺突蛋白中聚集体较少。MALS计算也表明，经修饰的样品其分子量略高，但尺寸更小，与预期的修饰效果相关性较高。经修饰的三聚体蛋白去糖基化后，分子量无变化。但是表观尺寸更小（6.3 nm），可能是由于蛋白质除糖后构象发生了轻微调整。

图5 野生型 (蓝色) 和两种修饰的WH刺突蛋白 (HexaPro: 绿色，HexaPro去糖基化: 红色) 的RI谱图和分子量分布重叠图

研究结论

使用SEC-MALS可以分析SARS-CoV-2三聚体刺突蛋白多种变体及其修饰版本的MW和Rg。且在不同变体、修饰或糖基化曲线之间检测到了轻微的分子量和尺寸的变化。

LenS3 MALS检测器能够测量10 nm以下的Rg，搭配使用TSKgel UP-SW Aggregate尺寸排阻色谱柱可实现高分离度和高灵敏度的分析，使我们能够检测三聚体刺突蛋白的结构及其显著差异。

当研发及质控分析中需要通过SEC-MALS技术表征刺突蛋白和其他复杂生物分子时，LenS3 MALS检测器和TSKgel UP-SW Aggregate色谱柱是非常理想的选择。

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参考文献

1. Herrera, NG., et al.(2020) Characterization of the SARS-CoV-2 S protein: biophysical, biochemical, structural, and antigenic analysis.2020.6(1): p85～102. doi:10.1101/2020.06.14.150607

2. Estes, MK and Cohen, J (1989) Rotavirus gene structure and function.1989.53(4): p410～449. doi: 10.1128/mr.53.4.410-449.1989

3. Li, X and Luk, HKH (2019) Human Coronaviruses: General Features, in Reference Module in Biomedical Sciences.2019, Elsevier. doi: 10.1016/B978-0-12-801238-3.95704-0