基于timsTOF fleX的深度空间代谢组学解决方案

2023-11-21 20:44:45, 质谱成像先锋队 布鲁克(北京)科技有限公司-质谱仪器


ASMS Poster# 布鲁克创新方案

MALDI 成像与传统代谢组学相结合

实现全景式分子信息表征

1前言

细胞是疾病的基础,组织的质谱分析为了解细胞内发生的变化提供了最直接、最灵敏的途径。常见的LC-MS组学分析技术需要先将样本做匀浆处理,然而,样本被匀浆后检测,会丢失待测分子的空间位置信息。质谱成像是一种原位分析技术,它可以直接从组织中获得上千种分子的空间分布信息。为了弥补组织匀浆法的不足,布鲁克公司综合上述技术的优势,率先推出了SpatialOMx®深度空间组学实验方案。首先借助 timsTOF fleX质谱仪的MALDI成像功能来识别并定位组织切片中的特定区域(ROI),再针对该区域、通过timsTOF fleX连接UPLC进行更加深入的4D-组学表征。图1展示了SpatialOMx®的工作流程示意图。

图1. SpatialOMx 工作流程示意图

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实验方法

制备冷冻的大鼠鼠脑组织切片(厚度10μm),附着到IntelliSlides®导电载玻片上,然后喷涂DHAP基质。通过布鲁克timsTOF fleX质谱仪以50μm的空间分辨率,在正离子模式下对鼠脑样本进行MALDI质谱成像数据采集。SCiLS™ Lab 2023a和MetaboScape® 2023a软件分别用于成像数据的统计分析和分子注释。首先,成像数据通过SCiLS™Lab 2023a软件进行无监督的统计分析—空间聚类分析,划分为不同的区域,此次实验划分为两个区域(图2B),用于后续的组学实验。

结合上述的区域划分结果,从一片连续的脑切片沿着边界进行切割、分别获取了图2B中两个区域所对应的组织。分别对两部分组织进行脂质分子提取:由400µL叔甲基丁基、80µL甲醇和200µL超纯水组成的提取缓冲液进行提取;涡旋,超声处理10min;3000rpm离心10min,取200µL上清液;然后用真空干燥器干燥约10min;最后用9:1的甲醇:二氯甲烷的混合溶液进行重悬。LC-MS分析实验条件:Intensity solo2 C18色谱柱(100x2.1mm),流动相A(乙腈:水:1M甲酸铵=600:390:10,添加0.1%甲酸),流动相B(异丙醛:乙腈:1M甲酸铵=900:90:10,添加0.1%甲酸),进样10µL。质控是通过对整片脑组织切片进行提取、处理,上样不同的体积,以此来确定各种脂质种类的检测限。

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实验结果与讨论

SCiLS Lab 2023a对大鼠鼠脑的成像数据进行空间聚类分析,可以划分成蓝色和黄色两个区域,如图2B所示,分别对应脑灰质和脑白质。

图2. 大鼠鼠脑的光学图像(A)以及SCiLS Lab中空间聚类分析的结果(B)。

将蓝色和黄色的区域分别切割下来,提取脂质后分别进行LC-MS/MS组学分析,获取了精确质量数、MS/MS以及碰撞截面积(CCS)值等信息,并通过MetaboScape 2023a软件进行了feature提取和分子信息标注。一共提取并标注了600个特征峰,对其中的11个脂质类别中的约100种脂质,采用Rule-based Lipid Annotations进行脂质注释,注释结果如图3所示。

图3. MetaboScape中4D-组学结果的可视化:样本数据文件中的部分特征峰列表(左图)和 HexCer 18:1;O2/24:1 化合物的详细信息,包括质子化、失水和加钠峰(右图)。

针对目标分子采集二级质谱数据,将获得的MS/MS谱图与NIST 2020 MS/MS数据库进行比对,以HexCer 18:1;O2/24:1为例,比对结果如图4所示。

图4. HexCer 18:1; O2/24:1二级数据的实测值(上图)和NIST 2020 MS/MS数据库的理论值(下图)

实验总共进样22次,包括5次空白对照,5次质控,以及从连续切片的脑组织中经过切割分别获得的两组组织样本(蓝色区域和黄色区域),每组各做了3次平行实验。结果如图5所示,左图为每个样本单独进样的峰强度值,右图为空白对照、质控、蓝色区域和黄色区域样本间的组别分析。

图5. 不同组别样本单次进样(左)及组别间信号强度的比较

通过MALDI质谱成像获得的HexCer 18:1;O2/24:1的空间分布图像如图6所示,HexCer 18:1;O2/24:1主要分布在脑白质区域。该结果与图5中经过LC-MS/MS组学分析所获得的含量趋势是一致的。

图6. 带有HexCer 18:1;O2/24:1分子标注的空间分布热图

4结论

布鲁克的timsTOF fleX质谱仪同时具备MALDI成像功能和LC-MS/MS组学分析功能,可以在同一台仪器上实现空间组学工作流程中的两大核心步骤。本文以大鼠鼠脑作为实验样本,通过MALDI成像实验,在空间上指导发现特定目标区域,并针对该区域进行深度4D-组学分析;配合SCiLS Lab和MetaboScape软件的使用,实现了生物分子的多维度、全景式空间信息表征。

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