RP-LC-MS/MS法定量mRNA中游离/非结合核苷

溶液A：5mM醋酸铵缓冲液。乙酸调pH到5.3

溶液B：乙腈。必须使用LC-MS级

梯度条件：见下表

用0.6U的核酸酶P1、0.2U的蛇毒磷酸二酯酶、0.2U的牛肠磷酸酶和10U的Benzonase核酸酶，在5mM Tris （pH8）和1mM氯化镁溶液中，37℃酶解2小时，将10μg的RNA酶切至核苷水平。另外，可以选择性地添加脱氨酶抑制剂，如喷司他汀（腺苷脱氨酶抑制剂，200ng）和四氢尿苷（胞苷脱氨酶抑制剂，500ng），以避免核苷降解。

标样：腺苷或另一种主要核苷（C, U或G）

色谱柱：Synergi Fusion, 4μm, 80Å孔径, 250×2.0mm; Phenomenex

柱温：35℃

流速：0.35mL/min

检测器：UV 254nm

质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）的三重四极杆（QQQ）

模式：正离子模式，dMRM（动态多反应监测）

ESI参数：气体温度300℃，气体流量7L/min，雾化器压力60psi，鞘气温度400°C，鞘气流量12L/min，毛细管电压3000v，喷嘴电压0v

QQQ参数：取决于必须检测的修饰核苷。建议对每台质谱仪的仪器参数（破碎器、碰撞能量、加速器电压）进行优化，以达到最佳灵敏度

用MS/MS法测定各修饰核苷的峰面积。

修饰核苷的量用腺苷校正，以消除进样量不同带来的差异。为此，从254nm处记录的紫外色谱中获取腺苷的峰面积。

通过在每个样品中加入同位素标记的标准物进行定量。

A(MS mod)=修饰核苷酸的MS峰面积

n(ISTD)=每个样品的内标量

A(MS ISTD)=内标质谱峰的面积

A(UV腺苷)=腺苷的峰面积

或者，可以选择另一种主核苷（C、U或G）进行校正。例如，在酶促多聚腺苷酸化的情况下，它会导致未知或不同数量的腺苷。

用MS/MS法测定各修饰核苷的峰面积。

修饰核苷的量用腺苷校正，以消除进样量不同带来的差异。为此，从254nm处记录的紫外色谱中提取腺苷的峰面积。

使用外部校准溶液进行绝对定量。准备浓度为0.1、0.5、1、5、10、50、100和500nM的校准溶液，用于MS/MS检测修正，每个修饰含有等量的内标。

每种稀释液注入10μL，在1-5000fmol范围内进行校准。对于腺苷，准备浓度为0.1、1、10和100fmol的校准溶液。每种稀释液注入5μL，在0.5-500pmol范围内进行校准。响应因子对应于校准曲线线性拟合的斜率（峰面积对应于各自的量）。

X(每个修主核苷的修饰量)=绝对定量，每个主核苷修饰量

A(MS mod)=各自修饰的MS峰面积

A(MS ISTD)=内标质谱峰的面积

n(ISTD)=每个样品的内标量

rf(MS mod/MS ISTD)=各自修饰物与内标物之比的响应因子

A(UV腺苷)=腺苷的紫外峰面积

RF(UV腺苷)=相应修饰的响应因子

X(mod/RNA)=绝对定量，每个RNA分子的修饰量

N(腺苷)=RNA序列中各自修饰的数目