干货分享|小干扰RNA（GalNAC-siRNA）的液相分析

小干扰RNA药物作为当前最具前途的治疗药物，具有基因沉默效率高，高度特异性，靶点范围广，可以实现长效作用，合成方便的特色。如何进行快速分析siRNA药物中的杂质以及siRNA药物与其正反义链杂质分离，反相离子对色谱法，阴离子交换色谱法和尺寸排阻色谱法是否都可以实现，哪种分离方式最优异？本篇以实验室合成的siRNA为例，使用反相DNAPac RP核酸专用柱，阴离子交换核酸专用柱DNAPac PA200和MAbPac SEC-1尺寸排阻色谱柱快速进行三种分离模式的方法开发。

反向离子对色谱法是分析寡核苷酸常用的方法，色谱柱的官能团，离子对试剂选择性，有机相的比例，梯度条件，柱温等因素影响分离效果^[1]，使用DNAPac RP大孔径，聚合物基质的核酸专用反相色谱柱，通过选择不同的离子对试剂，有机溶剂，优化梯度和温度条件，分离 GalNAC-siRNA 以及相关杂质。在 TEA-HFIP 体系中 GalNAC-siRNA 中可以检测到一些杂质组分。在此条件下，GalNAC-siRNA 可以跟 siRNA-AS, siRNA-S, siRNA-AS(N-1), siRNA(PO) 基线分开，siRNA的正反义链之间可以基线分离。如图（1）所示。

为了增加siRNA药物的抗酶解能力，提高靶向性，会在siRNA药物上做些氟代，硫代等修饰，为了增加靶向性，GlaNAC修饰也是一个不错的选择，经过这些修饰的siRNA,存在比较多的空间异构体，在进行定量测定时，检测灵敏度会比较低，Denaturing条件下能够将双链siRNA解链为单链，从而提高检测灵敏度。聚合物基质的DNAPac RP 耐110℃高温的特色^[2]，适合进行高温下对双链RNA的分离。如图（2）。对比不同温度下该 GalNAC-siRNA的分离，发现该 siRNA 在100℃下完全解链，而80℃只是部分解链。通过单标定位，可以确定该GalNAC-siRNA在100℃下，完全解链为正反义siRNA,如图（3）所示

阴离子交换色谱法，因其在native条件下可以得到更高的分辨率，常用于寡核苷酸杂质之间，特别是异构体杂质的分离和半制备，流动相组成，pH值，梯度条件，柱温，有机溶剂这些因素都会影响阴离子交换的分离效果。使用DNAPac PA200核酸专用色谱柱，以 20 mmol/L Na₃PO₄+1 mmol/L EDTA.2Na (pH8.0):ACN=9:1为缓冲体系，通过调整氯化钠的比例来实现 GalNAC-siRNA 与siRNA-AS, siRNA-S, siRNA-AS(N-1), siRNA-AS(P=O) 对照品分离。如图（4）所示

双链 RNA 或者 DNA 可以在高温下或者高 pH 下解链为单链，峰形更尖锐，能够更高灵敏度地检测 siRNA 的含量和代谢杂质。DNAPac PA200 耐受85℃的特色 ^[3]，可以在离子交换模式下进行 Denaturing 的 GalNAC- siRNA 分析。本实验以20 mmol/L 磷酸钠(pH8.0)，1 mmol/LDETA.2Na，10%ACN为流动相A，A相中添加1 mol/L 溴化钠为流动相B，采用20%B-100%B 的14分钟线性梯度，在85℃下，可以将双链 RNA 解链，如图（5）所示，siRNA-AS 链和 siRNA-S 链可以基线分开，并且与杂质对照也可以基线分离。

尺寸排阻色谱法，是根据不同大小的样品在色谱柱中的保留时间差异而进行分离的，siRNA属于双链RNA，其正义链或反义链杂质都属于单链。根据这种差异，尝试进行分离，通过优化流动相pH值，流动相盐浓度，有机溶剂添加量，温度这些条件，实现了siRNA与正义链和反义链的基线分离，但是正义链和反义链之间很难分开。如图（6）所示

在Nondenaturing条件下， DNAPac PA 200 ，DNAPac RP，和 MAbPac SEC-1 三款色谱柱在三种分离模式都可以实现 GalNAC-siRNA 与 siRNA 正反义链的基线分离。DNAPac RP 与 DNAPac PA200 两种分离模式，互为补充可以实现 siRNA 与其正反义链和更多杂质之间较好分离，SEC 方法仅适合分离 GalNAC-siRNA 与其正反义链杂质。Denaturing条件下，对于该双链RNA,反相模式需要在100℃下可以完全解链，离子交换模式下，pH为8.0时，在85℃下可以完全解链为单链RNA,并可以将相关杂质更好地分离，DNAPac RP和DNAPac PA200，耐高温，耐高pH的特色，非常适合多修饰的核酸药物分离。

最后附上一张siRNA相关检测项目的耗材选择卡，供大家参考：

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