天美讲堂丨光学显微镜中的照明技术

2023-10-23 21:21:14, 天美

要点

1.大多数样品均可用正置显微镜，但大体积样品或成像过程中需要从上方放入的样品需要倒置显微镜。

2.反射照明模式适用于不透明或较厚的样品，而透射照明模式适用于透明或较薄的样品。

3.明场模式最适合观察样品上的吸收特征，而暗场模式适合观察样品上的散射特征（如边缘和缺陷）。

光学显微镜简介

在本文中，我们将介绍一些最常见的光学显微镜术语，包括正置显微镜和倒置显微镜，反射和透射照明模式以及明场和暗场照明模式，并讨论了它们在不同研究领域的适用性。

正置显微镜与倒置显微镜

选择显微镜时的一个重要考虑因素是物镜相对于样品的位置。在正置显微镜中，物镜位于样品上方；而在倒置显微镜中，物镜位于样品下方。尽管在结构和外观上存在差异，但它们对样品具有相同的成像能力，可适用于不同的样品类型。

用正置显微镜观察样品时，样品表面朝上（朝向位于样品台上方的物镜）。大多数样品都可用正置显微镜成像，并可放置载玻片，孔板以及专门的温度、压力或电化学样品台。然而，有两种情况不适合用正置显微镜，即当样品太大而无法放在物镜下面时或在成像过程中需要从上方放入样品。这两种情况下，都需要倒置显微镜。

图1 正置和倒置显微镜中物镜相对于样品台和样品的方向。

在倒置显微镜中，样品表面朝下（朝向位于样品台下方的物镜），这表明至少样品的这一侧必须是平的。倒置显微镜更适合活细胞成像，其中一个例子是样品为活细胞培养系统（其中细胞沉到培养系统的底部，并且需要从上方进入以交换液体介质）。

反射照明与透射照明

由于可以用显微镜观察到从不透明半导体芯片到半透明组织培养物等一系列光学性质各异的样品，因此大多数用户可根据具体样品选择反射或透射照明模式。如图2所示，此为正置显微镜两种照明模式下的光路示意图。除此之外，倒置显微镜也有这两种照明模式。

图2 有反射（红色）和透射（蓝色）照明模式的正置显微镜。

如图2中的红色光路所示，反射照明模式被认为是任何不透明样品（如半导体芯片、聚合物、油漆、纸张、金属和药品）进行可视化的最佳模式。当使用反射照明模式观察样品时，光通过物镜到达样品表面，然后在从样品反射后重新进入物镜。在重新进入物镜时，光线同时到达相机中，实现对样品的可视化。

图3 固定在载玻片上的脂肪肝组织切片的反射和透射照明。

当对非常薄或透明的样品进行成像时，例如固定在载玻片上的细胞或组织培养物，透射照明是优先选择。如图2中的蓝色光路所示，使用透射照明时，光穿过样品并进入物镜，从而更好地观察透明样品的形态。在透射模式中，由于入射光不像在反射模式中那样通过物镜，而是由位于物镜相反侧的聚光镜收集来自透射的光，并将其集中到样品上。在具有两种照明模式的显微镜中，通过按下框架上的切换开关可以改变光路的方向。图3为两种照明模式下的样品，其中透射照明比反射照明对比度更好。

明场照明与暗场照明

光学显微镜中有两种主要的照明模式，明场和暗场。图4所示的反射明场照明模式中，光线通过半镀银反射镜反射到物镜中心。在反射暗场照明模式中，接入挡光板，反射镜变为全镀银环形反射镜，使光束沿物镜边缘向下。

图4 显微镜内反射明场照明模式和反射暗场照明模式的差异。

这两种照明模式的不同之处主要在于入射光的角度。一般来说，明场为从样品水平面45度到90度之间的锐角照射，而暗场为从0度到45度之间的斜角照射，如图5所示。在明场模式下，锐角光如果不被吸收，则主要被反射回物镜。这意味着吸收特征将在明亮的背景下呈现黑暗。而暗场模式中，由于倾斜入射角，光通常不被反射到物镜中，从而导致暗背景。暗场模式用于检测样品中的缺陷和边缘，缺陷和边缘会导致斜角照射的入射光被散射到物镜中。

图5 A) 明场和暗场入射角的差异；B) 暗场缺陷散射光的检测。

暗场需要专门的光学器件，对于反射暗场（如图4所示），需要专门的暗场物镜和鼻架。透射暗场也适用，需要一个暗场聚光镜。如图6所示，样品为固定在载玻片上的各种硅藻组成，其中暗场照明比明场照明提供更好的对比度。从暗场照明图像中可以看出，将光散射到物镜中的硅藻的边缘和精细结构与背景形成了很好的对比，并且对比度相对于明场模式有显著改善。