2023-10-19 14:43:38, 赛默飞生命科学 赛默飞世尔科技生命科学产品
最近有很多同学都来问,流式实验中到底要不要做Fc受体封闭?
直接上答案,要!要!要!重要的事情说三遍。至于这背后的原因,请听我细细道来。
01
什么是Fc受体封闭?
提到Fc受体封闭,首先要弄清楚什么是Fc受体。Fc受体是一类表达在某些细胞比如粒细胞、B淋巴细胞、树突细胞、巨噬细胞及自然杀伤细胞等细胞表面的受体蛋白 (图1)。Fc受体能够跟抗体的Fc段结合(图2),通过跟抗体的结合,Fc受体能够促进病原体、肿瘤细胞或者被感染细胞的清除(图3)。通过某种方式阻断Fc受体和抗体结合就叫做Fc受体封闭。
IgG是最常见的抗体类型,而能够跟IgG结合的Fc受体称为Fcγ受体,主要分为FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32a)、FcγRIIb (CD32b)、FcγRIIc (CD32c)、FcγRIIIa (CD16a) 和FcγRIIIb (CD16b)。
图1. Fcγ受体的主要类型及其分布的细胞类型。+, 组成性表达; –, 不表达; #, 诱导性表达; *, 表达依赖于FCGR2C等位基因状态。图片出处:Bournazos, S., Gupta, A. & Ravetch, J.V. The role of IgG Fc receptors in antibody-dependent enhancement. Nat Rev Immunol 20, 633–643 (2020). https://doi.org/10.1038/s41577-020-00410-0.
图2. IgG抗体结构及其与Fc受体结合的示意图。图片出处:Barb AW. Fc γ receptor compositional heterogeneity: Considerations for immunotherapy development. J Biol Chem. 2021 Jan-Jun;296:100057. doi: 10.1074/jbc.REV120.013168.
图3. Fc受体通过与抗体结合促进病原体,肿瘤细胞或者被感染细胞的清除。图片出处:Kang TH, Jung ST. Boosting therapeutic potency of antibodies by taming Fc domain functions. Exp Mol Med. 2019 Nov 18;51(11):1-9. doi: 10.1038/s12276-019-0345-9.
02
为什么要做Fc受体封闭?
对于这个问题,相信同学们在了解了什么是Fc受体及其特性之后也能猜出大概。没错,我们使用的流式抗体能够通过Fc段与细胞上的Fc受体结合,这种结合对于我们的流式实验来说就是一种“非特异性”的结合,会造成高背景和假阳性等问题。
在图4中,我们将未经Fc受体封闭和经过Fc受体封闭的THP-1细胞(人源单核细胞系)进行Anti-mouse IgG2aκ Isotype Control (APC)染色,发现未经Fc受体封闭的细胞有明显的假阳性信号(紫线),而Fc受体封闭能够有效的消除这部分信号(蓝线)。灰线代表未封闭也未染色细胞的自发荧光信号。
图4. Fc Receptor Binding Inhibitor Antibody
(货号:14-9161-73) 封闭效果检测图。
所以,Fc受体封闭能够有效的降低由Fc受体导致的背景信号甚至假阳性信号。
03
如何进行Fc受体封闭?
究其根本,目前常用的Fc受体封闭方法是在流式抗体染色前,添加封闭试剂来与Fc受体结合进行“占位”,从而使得Fc受体丧失结合流式抗体的能力,常见封闭试剂主要包括血清或者血清中纯化的IgG、抗CD16/32的抗体以及重组表达的Fc。这里列出了Invitrogen eBioscience针对不同种属细胞进行Fc受体封闭的产品。
04
Question & Answer
问
Fc受体封闭如何操作?
答
具体看封闭剂厂家的建议,如使用我司的产品,在流式抗体染色前进行封闭,具体操作如下。另外,封闭之后一般无需清洗即可进行流式抗体的染色。
小鼠细胞:将细胞用0.5-1 μg纯化的抗小鼠 CD16/CD32/100 μL 2-25°C预孵育10-20分钟。
人细胞:将细胞用20 μL纯化的人Fc受体结合抑制剂/100 μL 2-25°C预孵育10-20分钟。
问
如果我的细胞没有Fc受体表达,是否可以不做Fc受体封闭?
答
是的,如果确认没有Fc受体表达,可以不做。如果不确定细胞上有没有Fc受体表达,建议做Fc受体封闭,以防万一。
05
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