关于蛋白质互作组学你必须知道的“独门秘籍”

细胞功能受到蛋白质、核酸及其相互作用的严格调节，包括蛋白质-蛋白质相互作用（Protein–protein interactions，PPIs）、蛋白质-RNA相互作用和蛋白质-DNA相互作用。分子相互作用网络是大多数生物过程的核心，它们的失调与多种人类疾病有关，包括癌症、免疫紊乱和神经退行性变，因此阐明蛋白质的分子作用机制及各种复杂的生命现象具有重要意义。

蛋白质作为生命活动的执行者，其功能往往体现在与其他蛋白质的相互作用中，研究蛋白质/小分子-蛋白质相互作用对于人们深入了解和预防传染病、靶向治疗多基因疾病具有重要作用。大规模互作研究通过分析个体蛋白质组、表型特征以及环境因素之间的相互作用，揭示了个体差异和表型多样性的复杂性并为治疗干预提供见解。这种多样性在生物进化、人类健康以及疾病发生发展等方面扮演着重要角色。

研究者们开发了许多方法进行蛋白/小分子-蛋白的相互作用研究，包括经典的蛋白互作研究方法和基于质谱的蛋白互作研究方法。经典方法主要包括生物物理学的荧光共振能量转移 (FRET)、生物化学的免疫共沉淀和遗传学的酵母双杂交等。经典研究法的低通量、高噪音以及PPI实验的高成本难题亟待解决，因此高通量研究法需求应运而生。质谱仪具有高灵敏度、可高通量检测等优势，对蛋白质互作组学的研究能够弥补经典法的不足。

基于质谱（MS）的蛋白质组学已经从对生物物种中的蛋白质进行表征发展到在多个层面上评估蛋白质特性及其功能调节。通过工作流程各方面的最新进展（速度、灵敏度、精确性和稳健性），目前已经达到了可以在几个小时内对几乎完整的蛋白质组进行简化分析的水平。在这些技术发展的推动下，蛋白质互作组学得到了飞快发展——不仅可以表征互作蛋白质组，也可以询问生物活性分子的参与和反应性，解决蛋白质信号网络中的时空动力学，并在蛋白质组范围内产生翻译后修饰（PTM）的全面功能注释。

小编整理了基于蛋白质组学进行PPI研究的方法，主要包括亲和纯化质谱、共分馏质谱、临近标记、交联质谱和根据蛋白质的理化性质进行互作蛋白筛选^[1]。接下来将针对每个技术的原理及优缺点进行详细介绍，具体如下图：

图1 基于质谱的蛋白/小分子-蛋白相互作用研究方法汇总

在AP-MS中，用特定抗体或其他亲和试剂及其潜在的相互作用伴侣（猎物）从细胞或组织裂解物中选择性纯化诱饵蛋白。该步骤之后通过MS鉴定和定量这些纯化的蛋白质，然后用不同的诱饵重复AP-MS实验。然后统计计算来自这些AP-MS实验的诱饵-猎物对的组合以推断蛋白质网络。

图2  AP-MS技术流程

共分馏质谱是一种经典的蛋白相互作用研究方法。生物分子的时空共行为，如共表达或共定位，已被提出暗示功能或物理相互作用。细胞裂解物中的蛋白质复合物在非变性条件下通过色谱或电泳技术进行广泛分级。然后对每个组分进行蛋白水解，用LC–MS/MS进行分析，然后通过鉴定和量化其蛋白质组组成进行分析。随后，可以构建单个蛋白质复合物亚基的分级体系。由于完整复合物的亚基倾向于共分馏，因此可以根据这些数据对蛋白质复合物进行生物信息学预测，将分馏产物之间的相关性作为核心重要特征。

图3  coFrac-MS技术流程

PL是近年来发展并完善的一种鉴定蛋白相互作用的新方法。这种方法也被称为PDB-MS（Proximity-dependent biotinylation coupled MS）或BioID（Proximity- dependent Biotin Identification）。这个方法涉及表达与生物素连接酶（BioID）、辣根过氧化物酶（HRP）或过氧化物酶（APEX）基因融合的诱饵蛋白。融合酶能够将外部添加的生物素或酚类生物素催化成反应性生物素中间体，从而与诱饵附近的生物素化蛋白质不同。生物素标记后，裂解细胞，并使用链霉亲和素或中性链霉亲和素磁珠进行下拉，然后用MS进行鉴定和定量。

图4  PL技术流程

XL-MS是将蛋白质化学交联技术与质谱技术相结合，用于研究蛋白质结构以及蛋白质相互作用的新方法。在XL-MS中，选定的蛋白质或蛋白质复合物在其天然状态下首先与能够共价连接空间上接近的氨基酸残基的试剂进行化学交联。然后对交联的蛋白质进行蛋白质水解，分离得到的肽混合物，并用LC-MS/MS进行分析。随后对MS数据的数据库搜索阐明了交联肽的序列以及交联位点。

图5  XL-MS技术流程

根据蛋白的理化性质变化进行筛选是一种相对较新的非常规方法，其无需对原始分子进行结构修饰而用于蛋白质复合物动力学的研究。主要是通过跟踪靶蛋白的水解可及性、化学或热稳定性和溶解度的变化来监测蛋白的相互作用^[2]。这些方法主要分为四类，包括：化学变性依赖性方法-蛋白质的氧化率稳定性（Stability of proteins from rates of oxidation，SPROX）和脉冲蛋白水解（Pulse proteolysis , PP）；热变性依赖性方法-细胞热位移分析（ellular Thermal Shift Assay , CETSA）和热蛋白质组分析（Thermal Proteome Profiling，TPP）；蛋白水解抗性依赖性方法-药物亲和响应靶标稳定性（Drug affinity responsive target stability, DARTS）和限制性酶解-质谱分析技术(Limited proteolysis mass spectrometry, LiP-MS)以及溶解度依赖性方法（Solubility-Dependent Methods, SIP）。

图6  基于蛋白的理化性质进行筛选的技术流程

尽管上述技术的共同目的是定性地分离蛋白质复合物的确切组成，从这些实验中获得的额外信息可能会进一步阐明已鉴定PPI的结构和功能特性，但是具体如何选择呢？小编整理了各个技术的优缺点，让我们一起来看一下吧！

表1  基于MS的PPI识别和量化方法的优缺点

上述各个技术的优缺点提示我们在实际的应用中应根据不同方法的特性，结合实际的研究需求，制定更加科学和高效的方案，同时也可以采取相互验证的策略。

蛋白质相互作用研究为我们揭示了生命活动的基本规律，并为疾病治疗提供了新的途径。随着科学技术的不断进步，蛋白质相互作用研究将取得更多突破性成果，为人类健康事业带来更多福祉。跟踪蛋白性质变化进行挑选是一种新颖的非传统方式 ，用于研究蛋白质复合物相互作用 。青莲百奥提供无需进行化学修饰、适用于细胞裂物、活细胞、组织、细菌和真菌中进行蛋白/小分子-蛋白相互作用高通量筛选的限制性酶解-质谱分析技术（点击查看LiP-MS技术详解）和热蛋白质组学分析技术（点击查看TPP技术详解），欢迎大家前来咨询~

参考文献

[1] Low T Y, Syafruddin S E, Mohtar M A, et al. Recent progress in mass spectrometry-based strategies for elucidating protein–protein interactions [J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2021, 78(13): 5325-5339.

[2] Feng F, Zhang W, Chai Y, et al. Label-free target protein characterization for small molecule drugs: recent advances in methods and applications [J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2023, 223.