荧光定量PCR常见问题分析（一）——通用问题篇

2023-09-28 14:51:10, TAS团队赛默飞世尔科技生命科学产品

虽然新冠的阴影已经慢慢从我们的生活中抹去，但是想必大家对核酸检测、Ct值等词语依然记忆犹新，而新冠核酸检测是在实时荧光定量PCR（qPCR）仪上完成的众多检测项目之一。qPCR实验虽然简单，但难免会遇到各种小问题：试剂如何使用？软件如何正确设置？数据结果为什么异常？……

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别急，技术支持团队为您总结了qPCR的常见问题分析，整理成qPCR实验避坑指南。本篇我们节选了部分比较常见的通用问题分享给大家，接下来还会陆续推出QS3/5、7500、StepOnePlus以及试剂的常见问题分析。无论您是新手还是行家，这些问题和解决方案都将对您的实验提供有用的指导，各位赶紧收藏吧！

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绝对定量实验，扩增曲线（Amplification Plot）是正常的（图1），但没有显示标准曲线（图2），是什么原因？如图7500软件。

图1

图2

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该数据中将不同浓度的标准品设成了不同的Target（图3），且标准品的Quantity设置也有误，所以无法显示出正常的标准曲线。应该把检测同一个基因的所有标准品孔、样品孔都设为同一个Target，并按标准品浓度或拷贝数填写Quantity。此例可以在Setup->Plate Setup->Assign Targets and Samples界面修改设置后再点击Analyze重新分析数据，就可以得到正常的标准曲线（图4）。

图3

图4

扩增曲线（Amplification Plot）异常，显示为杂乱折线，标准曲线显示为空白（图1），多组分图（Multicomponent Plot ）有扩增信号（图2），是什么原因？如图7500 软件。

图1

图2

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该实验中使用了单独添加ROX染料的试剂，在部分孔中添加了ROX染料，部分孔中没有添加ROX染料，而在分析时选择了Passive Reference 为ROX，导致分析后数据出现问题，建议在没有添加ROX染料或ROX染料浓度不合适时，选择Passive Reference 为None（图3）, 点击Analyze重新分析后，扩增曲线和标准曲线都能正常显示（图4）。

图3

图4

实验结束后扩增曲线（Amplification Plot）异常且Ct值显示为 “Undetermined”（图1），这是什么原因？如图QS5 软件。

图1

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查看原始数据的多组分图（Multicomponent Plot），发现所有样本均未扩增（图2）。查看反应程序设置，发现qPCR反应条件设置有误，95℃ 高温变性步骤放在了Hold Stage ，而PCR Stage 中的40个循环只包含了58℃ 退火延伸步骤（图3），因此导致扩增失败，只能重新进行实验。

图2

图3

染料法进行定量实验，实验结果显示扩增曲线（Amplification Plot）异常（图1），多组分图中（Multicomponent Plot）也显示扩增曲线在基线期就出现了信号的抬升（图2），这是什么原因？如图7500 软件。

图1

图2

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通过查看多组分图，发现扩增曲线在基线期信号就有抬升，该现象可能是由于cDNA中有大量基因组DNA污染导致的。当PCR反应中存在一些非平末端的含5’-overhangs双链DNA片段时（图3），Taq DNA聚合酶会结合上去，将这部分缺失的碱基补齐，形成新的双链片段，这时SYBR Green染料就会和新合成的DNA双链发生结合，当这种片段足够多时，就会出现扩增曲线基线期抬升的现象。建议出现这种情况时首先注意检测RNA的质量，RNA提取时使用DNA酶进行消化处理，避免产物中有基因组DNA的污染。

图3

qPCR实验，耗材使用的是八联管。多次数据第一行的扩增信号和其他行相比很弱（图1，蓝色方框中是第一行样本的扩增信号，红色箭头所指为第二行样本的扩增信号），这是什么原因？如图QS5软件。

图1

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查看原始数据的多组分图（Multicomponent Plot），第一行的原始荧光信号确实是比第二行要低（图2，蓝色方框中为第一行ROX的扩增信号，红色箭头表示的是第二行ROX的扩增信号），初步推测第一行的荧光信号采集时受到了影响。在排查耗材使用和实验操作后，发现是在第一行的管盖上使用了记号笔标记，这会影响仪器对荧光信号的采集，规范实验操作之后实验荧光信号正常。