ACD/Labs AutoChrom用于药典方法评估及优化

ChP2020和JP XVIII方法重现结果：各杂质可达到基本分离，仅杂质D与未知杂质出峰重合。对比各组分分布和峰型，主峰前杂质出峰紧凑，峰形尖锐，较好。主峰后杂质出峰间隔时间较长，峰形矮胖，灵敏度不高。可能存在杂质漏检，或较晚出峰影响下一针检出情况。

醋酸溶液做流动相225nm、254nm波长下的加标供试品溶液对比图

综上，下一步在色谱柱Welch Xtimate C18（4.6*150mm，5μm）下，采用ACD辅助FLH-501方法优化，探索FLH-501方法耐用性。

注：++主要影响；+次要影响；-相对影响很小；0没有影响

根据分离度公式和分离条件对k、α、N的影响表筛选方法关键因素，方法无需使用离子对试剂，在选定色谱柱Welch Xtimate C18（4.6*150mm，5μm）下，主要可以通过改变B种类（乙腈、甲醇等）、%B、和流动相pH改善分离度。

B种类（乙腈、甲醇等）：甲醇为氢质子供体，乙腈为氢质子受体，提供不同选择性，进行对比，发现乙腈做为有机相，各组分分离较好，故有机相直接选择乙腈，B种类不参与DOE实验设计。

流动相pH：由各已知组分logD图，考察组分含有酸碱基团，方法流动相pH对保留和分离存在影响，需作为DOE实验设计进行考察。对logD图分析，方法流动相选择酸性平台期pH较佳。药典方法流动相醋酸水溶液测定pH为2.4，故流动相pH选择pH2.1、pH2.5、pH3.0进行考察。

梯度程序：梯度程序为方法关键条件，选择固定初始和最终有机相比例更改时间20min、30min、40min方式设置三个点进行考察。

设计流动相pH及梯度程序的两因素实验，共9个实验，设计见下：

（1）梯度的影响：同一流动相体系下，以pH2.5样本为例对比不同梯度的结果见下图：

   同一流动相体系，不同梯度下，主峰后杂质洗脱能力和分离发生显著变化，显示梯度能够改变k和选择性a。

（2）pH的影响：同一梯度时间，以最长梯度时间为例对比不同流动相体系的结果见下图：

在相同梯度条件不同pH值条件下，流动相pH对杂质E出峰位置及分离有显著影响。

根据上述条件所采集的数据于ACD/AutoChrom 上进行建模，并分析方法耐用性空间。

对建模进行准确度分析，建模结果显示预测值与实测值之间无明显差异，说明模型预测准确度良好。

通过ACD优化，发现流动相pH对杂质E出峰影响很大，杂质E含两个羧基，结合logD，杂质E应随流动相pH变大保留降低，符合酸性化合物保留规律。梯度对各组分出峰影响很大，因药典收载的各组分均出峰较早且保留较近，故梯度程序的小幅度变化均对其有显著影响。

考虑方法耐用性，发现药典比例35%B%下维持30min各组分保留分布均较好。通过筛选确定的色谱条件和预测图谱见下。

根据预测条件设置方法参数进行重现：

预测方法下，各组分均能达到基线分离，且峰型较好。

对比美国药典、中国及日本药典方法重现图谱，优化后方法，主峰后杂质峰形及分离得到改善，杂质D与相邻杂质能实现基线分离，主峰前各杂质分离改善。

pH2.2磷酸盐缓冲液做流动相210nm、254nm波长下的加标供试品溶液对比图

对比210nm和比254nm波长下，加标供试品溶液图，各组分检出基本一致，对比药典醋酸溶液做流动相下的不同波长图，磷酸盐缓冲液做流动相，紫外截止波长较低，低波长下基线和各杂质检出均较好，同时在方法选定流动相pH2.2下，磷酸盐缓冲液具有强缓冲能力。