技术文章: 利用具有功能化探针的力-距离光谱对单分子相互作用进行分析

2023-08-25 17:50:01, Park原子力显微镜 Park帕克原子力显微镜

利用具有功能化探针的力-距离光谱对单分子相互作用进行分析

Park Systems应用中心

介绍

分子识别过程是指两个分子对（如受体-配体、蛋白质-蛋白质和蛋白质-聚糖）之间的特异性结合事件。在术语中，相互作用的大分子被称为“受体”，与受体伴侣结合产生生物反应的小分子被称之为“配体”。分子复合物的特定相互作用和机制以及对生物和物理功能的影响有助于我们了解各种生物功能，如细胞粘附、基因组复制和信号传导[1]，[2]。

当前有很多技术来研究生物分子伴侣的结合亲和力，例如表面等离子共振 (SPR)、核磁共振 (NMR)、光学或荧光光谱以及石英晶体微天平 (QCM) [3]、[4]。随着生物识别检测技术的发明，单分子相互作用的探索成为可能，从而为生物相互作用研究提供了更深入的了解。

在单分子技术中，力-距离光谱是原子力显微镜（AFM）的操作模式之一，是研究生物复合物强有力的工具之一，可以在生理条件下以高分辨率和高灵敏度检测分子间的结合力[5-8]。

AFM是一种用于获取具有纳米空间分辨率的样品表面形貌信息的成熟技术。AFM 还可以测量带有或不带有标记或处理的样品的机械性能。力-距离光谱表现出单皮牛顿或纳牛顿的力灵敏度，探针针尖和样品之间的横向接触区域很小。这些特点使其适用于研究生物识别过程中的分子特征。在一个典型的实验中，通过将目标分子附着到AFM针尖来对AFM针尖进行功能化处理，同时用目标分子伴侣对基底进行修饰。AFM可以在流体中操作，因此可以在生理条件下测量生物分子相互作用，如受体-配体、蛋白质-蛋白质和抗原-抗体相互作用（图1）。

图 1. 用于生物识别过程的单分子力-距离光谱应用示例。(a) 肽-无机材料相互作用，(b) 受体-配体相互作用，(c) 肽-肽（或蛋白质）相互作用。

使用功能化 AFM 探针的力-距离光谱

AFM 探针功能化——有几种方法可以将分子粘附到 AFM 针尖。最常见的方法是在镀金的AFM针尖上形成氨基自组装单层（SAM）[9]。使用此方法进行AFM 探针功能化的第一步是采用金-硫醇化学。为了将硫醇化分子结合到镀金的AFM探针针尖，通常使用具有10～18个碳原子的烷硫醇分子。这些链长可以提高氢键和结合的稳定性[10]。在连接链烷硫醇分子之后，可以将所需的配体分子直接固定到AFM针尖。然而，在这种情况下，可能会发生许多非特异性结合。为了避免这种情况，就使用了间隔分子。聚乙二醇（PEG）是用于单分子相互作用分析的常用聚合物间隔物。例如，在PEG24的情况下，它的长度约为9～10nm，通过这个已知的长度，可以在力-距离 (FD) 曲线中确定相应结果是特异性还是非特异性相互作用。由于大多数生物相互作用都非常微弱，通常建议使用弹簧常数较小（小于0.1 N/m）的AFM探针。

力-距离光谱–FD曲线描述了AFM针尖与样品相互作用的结果，作为两者之间距离的函数。为了测量相互作用，AFM针尖直接朝向样品移动，直到达到阈值，然后再次缩回。

在典型的力-距离光谱中，如图2所示，FD曲线测量的第一步是“接近”。探针的位置远离样品表面，意味着没有可测量的力影响悬臂偏转变化。接下来，通过将AFM探针针尖向样品表面接近并在它们之间“接触”（达到排斥状态并达到（预设）阈值）来显示接近曲线。在接近之后，针尖的z-向移动被反转，从而导致针尖从样品表面缩回。在缩回曲线期间，获取针尖和样品之间的附着力。最后一步是“拉脱”，即针尖和样品之间的距离达到临界点，这意味着悬臂上的拉力克服了针尖-样品之间的附着力，因此样品和针尖之间没有接触。

图2.具有FD曲线的力-距离光谱示意图

单分子相互作用决定了两个分子之间相互作用的特异性。利用AFM进行的一般受体-配体相互作用测量中，受体附着在样品表面，配体附着到针尖。当附着配体的AFM针尖与含有受体的基底接触时，它们之间发生结合。然后，针尖从表面缩回，与受体配合，将配体从其结合位点拉出。记录悬臂的偏转信号，该偏转信号可以通过受体-配体特异性相互作用来计算力。通常，FD曲线的最大粘附力（拉力）称为受体-配体结合力。此外，可以确认由于聚合物间隔物（通常为PEG24，9～10nm长度）引起的断裂长度（图3）。

图3.具有 AFM 功能化探针的代表性 FD 曲线。该曲线包括结合力（特定相互作用）和两个分子之间的断裂长度。

尽管力-距离光谱可以提供各种机会来确定皮克到纳米级的单分子相互作用，但在不同的实验条件下，仍然记录了未知、模糊和有争议的结果。以这种方式，必须考虑与实验参数或分析程序有关的一些问题，才能获得可靠和可重复的结果。

i.单分子相互作用的研究需要单个生物分子对有效地参与它们的相互作用。FD曲线有时显示非常尖锐、大或多个结合事件，而不是所需的特异性结合。为了获得结合事件的准确信息，需要考虑对AFM针尖和基底表面的功能化过程的控制，例如分子附着的密度或孵育时间。

ii. FD曲线结果受到缓冲液组分、意外分子以及有时所需分子对之间存在的非特异性结合力的影响。因此，需要通过确定假阳性相互作用，在所有数据集中建立区分特异性和非特异性相互作用的标准。

iii.在进行统计分析时，应考虑对大量FD曲线结果进行详细和适当的数据解释。为了建立可靠的定量信息，需要进行大量的FD曲线和选择可靠的FD曲线进行数据分析。在此过程中，必须从数据集中删除FD曲线的非特定或奇怪形状。

用于单分子相互作用分析的FD曲线案例

图4描绘了针对每种类型的分子伴侣测量的 FD 曲线。图4（a）显示了两个分子之间的特异性结合力。在回缩曲线中，粘附力是指两个分子的结合力，可以证实，当两个分子之间的相互作用通过间隔物引起的断裂长度被打破时，就会产生这种结合力。这意味着根据回缩曲线的非线性部分计算的断裂长度预计与拉伸下的间隔物的断裂长度几乎相似。图4（b）显示了一个无结合事件。没有任何可检测的结合事件，也没有相互作用。图4（c）解释了靶分子的双重结合事件。这不仅是由多结构域相互作用引起的，还因为功能化AFM探针针尖的两个分子与基底上的两个伙伴分子结合。图4（d）表明AFM针尖和基底之间的非特异性结合力，可能没有分子的连接。一般来说，对于非特异性结合力，断裂长度是不确定的。此外，它表现出比特异性结合力大得多的力值，而非特异性结合力的原因有多种，但通常是由于预期的两个分子相互作用以外的意外材料之间的相互作用引起的。图4（e）、（f）显示了多重结合事件拉伸的例子，如多价特异性相互作用、分子拉伸和一些非特异性相互作用的例子。在多重结合的情况下，它可以预期为两个或多个分子之间的反应，而不是单个分子之间的相互作用，并且它可能是一种意想不到的相互作用。当几个聚合物链参与反应时，可以发生多次拉伸。由于单分子相互作用是一个必须非常小心地处理各种化学物质和生物材料的实验，因此许多变量会影响FD曲线的结果。一般来说，图4（c）-（f）的情况不是我们想要的结果，除非出于特殊目的必须检查两次或多次交互。如果仅在少数情况下确认了双重/多重/非特异性相互作用，则可以忽略它们，但如果连续获得重复或大量不适当的结果，则需要进行故障排除，如针尖/样品制备或力-距离光谱参数的调整。

图 4. 单分子相互作用分析的 FD 曲线示例，红线和蓝线分别表示接近和缩回曲线。特异性结合 (a)、无相互作用 (b)、双重结合 (c)、非特异性结合 (d)、多重结合 (e)、多重拉伸 (f)。

总结

在本应用说明中，我们讨论了一种基于AFM的单分子力-距离光谱方法，该方法可以测量与形成配体-受体对的两个分子之间的特异性结合相互作用相关的粘附力。了解生物复合物系统中两种特定分子的相互作用对研究相应的生物功能具有重要作用。研究控制非共价分子键的结合机制，了解生物分子复合物的强度，可以从根本上理解特定物种如何相互作用，从而阐明生物识别系统，为未来的应用和生物或医学研究铺平道路。

参考文献

[1] Dupres, V., Verbelen, C. & Dufrêne, Y. F. Probing molecular recognition sites on biosurfaces using AFM. Biomaterials 28, 2393-2402 (2007).
[2] Ha, T. & Selvin, P. R. Single-molecule techniques: A laboratory manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2008).
[3] Deniz, A. A., Mukhopadhyay, S. & Lemke, E. A. Single-molecule biophysics: at the interface of biology, physics and chemistry. Journal of the Royal Society Interface 5, 15-45 (2008).
[4] Neuman, K. C. & Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature methods 5, 491 (2008).
[5] Noy, A. Handbook of molecular force spectroscopy. (Springer Science & Business Media, 2007).
[6] Florin, E.-L., Moy, V. T. & Gaub, H. E. Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs. Science-AAAS-Weekly Paper Edition-including Guide to Scientific Information 264, 415-417 (1994).
[7] Moy, V. T., Florin, E.-L. & Gaub, H. E. Intermolecular forces and energies between ligands and receptors. Science 266, 257 (1994).
[8] Ebner, A. et al. in STM and AFM Studies on (Bio) Molecular Systems: Unravelling the Nanoworld 29-76 (Springer, 2008).
[9] Hinterdorfer, P., & Dufrêne, Y. F. Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy. Nature methods, 3(5), 347-355 (2006).
[10] Yan, J. & Dong, S. Self-assembly of the pre-formed inclusion complexes between cyclodextrins and alkanethiols on gold electrodes. Journal of Electroanalytical Chemistry 440, 229-238 (1997).