“飞”凡创新季 | Bigfoot高光系列应用之——全光谱高维分选小鼠干祖细胞

2023-08-15 13:37:03, 赛默飞生命科学 赛默飞世尔科技生命科学产品


全光谱流式细胞术是近年来发展起来的一种新型流式检测技术,因其能够解析光谱特征高度相似的不同染料而备受瞩目。通过全波长光谱解析,可以大大扩展流式实验方案的分析维度,从而发现传统流式检测不出来的稀有细胞亚群。

下文我们详细阐述了利用Bigfoot全光谱流式分选仪和新型光谱染料来鉴定和分选稀有小鼠干祖细胞的高维流式技术路线。此外,通过26色小鼠造血细胞panel展示了Bigfoot SQS软件的新功能,以及光谱流式配色方案设计和合适的对照设置能够更好地进行细胞表型分析和亚群鉴定。利用Bigfoot全光谱流式细胞分选仪,该实验方案详细阐明了小鼠淋巴组织中造血系统发育的不同阶段,并且可以高效地分选出纯度很高的稀有细胞亚群。

材料和方法

通过标准方法采集和制备BALB/c小鼠的骨髓和脾细胞样品。实验中所用到的流式抗体详见下表,此外染色中还分别使用Invitrogen™ eBioscience™ Flow Cytometry Staining Buffer、Invitrogen™ Super Bright™ Complete Staining Buffer和Invitrogen™ CellBlox™ Blocking Buffer以减少非特异性染色;用Invitrogen™ LIVE/DEAD™ Fixable Olive viability dye进行死活染色,最后用2%多聚甲醛进行固定。在6激光Bigfoot全光谱流式细胞分选仪上进行样本采集和细胞分选。

大部分指标用Invitrogen™ Ultracomp eBeads™ Plus Compensation Beads做补偿对照,用骨髓和脾细胞做对照的指标详见表中标黄部分。

数据结果分别用FlowJo™ v10.8.1和Sasquatch Software (SQS)软件进行分析。

表1. 小鼠造血细胞发育26色实验方案,包括抗原、抗体克隆号、染料及单阳管对照。

结果

图1. 血细胞发育树状图。该实验成功鉴定出的细胞亚群用蓝色标记,分选出的亚群用绿色标记。

图2. 骨髓样本中排除黏连细胞、死细胞、红细胞和成熟细胞亚群后的流式结果。A) 设门策略展示。B) 细胞分选时在SQS软件中看到的2D散点图。

图3. 骨髓样本进一步排除系特异性指标后进行造血祖细胞设门。A) 设门策略展示,蓝色代表设门进度,绿色代表分选的细胞亚群。B) 细胞分选时在SQS软件中看到的散点图。C) 用于设门的FMO对照示例。

图4. 分选统计和分选后纯度检测。分选的4个细胞亚群:巨核细胞-红系祖细胞(MEP);粒细胞-单核系祖细胞(GMP);通用髓系祖细胞(CMP);小前B细胞。A) 分选和丢弃的总细胞数。B)分选效率。C)GMP和 D)CMP分选纯度检测。分选纯度检测时设门策略未进行调整。

图5. 骨髓样本所有流式结果图一览。

图6. 脾细胞样本所有流式结果图一览。

结论

我们展示了如何利用Bigfoot全光谱流式细胞分选仪成功鉴定出23个小鼠造血细胞亚群,并且高效、高纯度地分选出稀有的祖细胞亚群。

下一步研究方向:

拓展实验方案,增加其它指标以区分更多的细胞亚群

细胞直接分选至测序芯片上

下面简单介绍一下本实验用到的流式细胞仪、抗体试剂以及赛家流式培训课程。

Bigfoot全光谱超高速流式细胞分选仪

——高效、准确、安全、灵活

Bigfoot是全球第一台全光谱、超高速、高性能的流式细胞分选仪,具有强大的光谱解析和分选能力,是免疫学研究和生物医药开发领域的强有力工具。

其主要技术优势如下:

配置高达9激光60参数

实时全光谱拆分及传统补偿调节模式可供选择

超高的分析和分选速度

强大的分选性能及灵活的分选模式

整合式II级生物安全柜及气溶胶管理系统

智能型全自动仪器校准及质控

流式抗体及试剂

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