新方法 | 提高AAV表征灵敏度与效率，SEC-MALS前来助力！

2023-08-11 20:56:28, 沃特世沃特世科技（上海）有限公司

腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）是一种高效安全的转基因载体，因其能长期表达、毒性低、组织特异性高等优势，已成为基因治疗领域最重要的基因载体之一。

而AAV的难点在于精确控制药品的效价、效力、纯度以及空壳率。采用体积排阻色谱法与多角度光散射（MALS）相结合，可以表征AAV样品成分，包括分子量、衣壳和DNA的摩尔质量、聚集体和滴度。沃特世XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm色谱柱能为摩尔质量、分子量、聚集体检测以及空壳率监测提供高灵敏度和高效率的方法。

产品优点

更好的分离效果
实现MALS低噪声，测量完整AAV
快速区分聚集体和单体，实现相对定量
适用多种AAV血清型，样品用量少，提升灵敏度和回收率

分析方法

SEC-MALS分析AAV病毒载体的质量表征

SEC可与MALS联用，进行更多属性的分析。通常SEC结合UV、FLR、RI检测器，根据溶液中分子量的大小来分离，但无法将空AAV和实心AAV分离出来，所以需要通过SEC -MALS来分析样品的分子量、聚集体、颗粒及衣壳含量。Wyatt ASTRA软件利用UV、RI、MALS、DLS的数据组合来确定分析物的物理属性，包括其粒径、分子量和衣壳含量。

图1. Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm 4.6 x 150 mm色谱柱分析BSA（2 mg/mL）、BTG（4.5 mg/mL）和 AAV2-空衣壳（2E⁺¹³ vg/mL）的SEC色谱图。

表1. 用SEC-MALS测定AAV2、BTG和BSA的生物物理特性。

SEC-MALS增强AAV的表征

在低流速（<0.3 mL）条件下，XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm色谱柱表现出低MALS噪声和高灵敏度MALS信号检测。

图2. Premier GTx SEC 450 Å 2.5 μm 4.6 x 300 mm色谱柱分析SEC-MALS AAV2-EMPTY衣壳的特征色谱图。

通过SEC-MALS分析AAV9血清型（空衣壳）

AAV以多种血清型存在，但并非所有血清型都表现出相似的成分特征。通过SEC-MALS分析AAV9（空衣壳）血清型，Premier GTx SEC 450 Å 2.5 μm 4.6 x 300 mm色谱柱可有效分离AAV9单体中的聚集体。

图3. Premier GTx SEC 450 Å 2.5 μm 4.6 x 300 mm 色谱柱分析AAV9-空衣壳色谱图。

重现性一致

按照Empower软件的建议放大进样体积和流速（4.6 mm为15 μL，7.8 mm为43.1 μL，流速分别为0.2 mL至0.575 mL），增加柱直径。两种色谱柱的SEC-MALS色谱图呈现一致性。

图4. 两种不同尺寸（4.6 x 300 mm 和 7.8 x 300 mm）的Premier GTx SEC 450 Å色谱柱的数据比较。

结论

XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm色谱柱对不同AAV血清型体现了出色的分辨率和高效MALS分析能力，可有效分离各种AAV样品的聚集体、单体和低分子量杂质。4.6 mm直径的SEC色谱柱可配对大型流通池MALS检测器。SEC-MALS提供了强大的多属性分析功能，如确定空载率以及快速测量绝对摩尔质量和分子量。