乳腺肿瘤模型中缺氧标记物吡莫硝唑的质谱成像

肿瘤缺氧与肿瘤的侵袭性和肿瘤治疗的耐药性息息相关，但许多缺氧导致的肿瘤变化细节仍然有待进一步研究阐明。

摘要 

乳腺肿瘤模型中缺氧标记物吡莫硝唑的质谱成像

质谱成像技术是一项非常合适研究特定组织区域（例如乏氧取样）生物分子组成的技术。荷兰Ron M.A. Heeren课题组选取吡莫硝唑作为缺氧标志物，在低氧细胞中，吡莫硝唑被还原形成新的反应物，这些反应物可以与蛋白质、肽和氨基酸中的巯基结合。利用基质辅助激光解吸电离质谱成像技术（ matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging, MALDI MSI)，在乳腺癌异种移植模型中，吡莫硝唑代谢物作为标志物可以对肿瘤缺氧区域进行可视化分析及定位。

01

吡莫硝唑

吡莫硝唑是一种可靠的缺氧标志物，并被批准用于临床。它具有质谱检测所需的良好化学性质，如微碱性的哌啶侧链。吡莫硝唑仅在低氧条件下被还原，形成与细胞亲核试剂结合的反应性产物，特别是含巯基的生物分子。吡莫硝唑的MALDI质谱检测分子信号为m/z 255.1，同时产生一系列碎片信号m/z 98.1、124.1、142.1、223.2和226.2(图1)。

Figure 1. MALDI mass spectra of pimonidazole obtained from the pure compound and from tumor tissue from a pimonidazole-injected mouse. (a) MALDI mass spectrum of pimonidazole. Shown are the protonated parent ion at m/z 255.1 and its main fragments. Inset: Chemical structure of pimonidazole with characteristic fragments as determined by MS/MS. On-tissue MS/MS analysis shows that m/z223.2 is a pimonidazole-derived ion. MS/MS spectra of m/z 223.2 from (b) pimonidazole and (c) pimonidazole-treated tissue.

02

小鼠成像分析

利用大气常压质谱成像仪器（AP-SMALDI10, TransMIT, Giessen, Germany，Q Exactive, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany）对注射吡莫硝唑的小鼠乳腺癌肿瘤进行成像分析，检测到吡莫硝唑特征信号m/z 124.1, 142.1和223.2(图2)。

Figure 2. MALDI-MSI analysis shows the distribution of pimonidazole-derived ions in tumor tissue. (a) Pimonidazole (Pimo)-derived ions with m/z 124.1, 142.1 and 223.2 are solely detected in tumor tissue from pimonidazole-injected mice, and not in control tumor tissue. (b) MALDI-MSI spectra (zoom) from treated (red) and untreated (black) tumor tissue. Presence of pimonidazole-derived ions is indicated with an arrow. 

03

衍生物对比分析

在肿瘤缺氧区域，吡莫硝唑被还原形成新的反应物，这些反应物与巯基化合物结合，AP-SMALDI MSI可以清晰看到这些还原性吡莫硝唑衍生物的分布及含量情况（图3）。通过对比吡莫硝唑的特征碎片和衍生物的分布情况，发现二者分布一致，其中碎片m/z 223.2的质谱信号强度是其余衍生物的5倍，更易被质谱检出，因此，作者认为吡莫硝唑的特征碎片m/z 223.2可以作为质谱检测生物组织中缺氧区域的生物标志物，该结果也被免疫组化实验数据所证实。

Figure 3. AP-SMALDI MSI of a tumor tissue section showing the distribution of pimonidazole-derived ions. A different distribution was observed for m/z 201.17070 and 223.15515 as compared to the distribution for the parent compound at m/z 255.14499 and the side chain fragment at m/z 142.12268. The overlay of m/z 223.15515 (blue) and m/z 255.14499 (red) shows overlap of the two ions only at the border of the tissue section (pink). The intensity for each ion was normalized to the total ion count (TIC) per pixel. 

04

MALDI-MSI成像分析

对肿瘤组织缺氧区域的生物分子进行MALDI-MSI成像分析，发现三个离子信号与缺氧区域分布一致，经二级质谱鉴定得到两个信号的分子信息，分别为1-甲基烟酰胺（ m/z 137.1）和乙酰肉碱（ m/z 204.1），另一个信号尚未鉴定。先前的MALDI-MSI成像研究中在相同的肿瘤模型中发现可以定位缺氧组织的两个乙酰肉碱，分别为棕榈酰肉碱和硬脂酰肉碱。该文章中作者同样发现硬脂酰肉碱与吡莫硝唑信号分布一致（图4）。肉碱和乙酰肉碱是乙酰辅酶A的代谢过程中重要的代谢分子，作者提出肿瘤缺氧与辅酶A的稳态和乙酰肉碱与游离肉碱比例的增加有密切的关系。

Figure 6. Correlation of m/z 223.2 with other m/z features as determined by Pearson’s correlation. 1-methylnicotinamine, C8H18NO2 and acetylcarnitine were found to be highly correlated with m/z 223.2. Data are shown for one representative tumor section. 

总结 

该文章提出了一种MALDI-MSI方法，该方法使用吡莫硝唑特征信号m/z 223.2来成像缺氧组织区域。定位于低氧组织区域的几种内源性物种，例如脂质和小分子，这些被鉴定的物种被认为与癌症中的缺氧或代谢重编程有关，尽管它们的具体作用仍有待阐明。吡莫硝唑作为组织缺氧标志物，作者期望所提出的MALDI-MSI方法也适用于注射吡莫硝唑的动物或人的其他组织。

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