DNA/RNA修饰酶在生物学前沿研究中的应用举例

基础的生物学问题研究已经为今天的分子生物学家、诊断试剂或治疗药物开发人员带来了诸多前沿应用。50多年前，一个简单的生物学问题 – 噬菌体T7如何启动早期转录基因和晚期转录基因的转换–导致了T7 RNA聚合酶（RNAP）的发现。[1] 通过后续更多的研究，T7 RNAP催生出了许多我们现在普遍使用的技术方法，如体外转录（IVT）。IVT是许多现代科学研究流程的关键，也是Pfizer/BioNTech和Moderna的COVID-19 mRNA疫苗生产的关键生产步骤。[2]

同样，对于基因组DNA在细胞内的长期稳定性，以及它如何承受内源性或外源性损伤这样的数十年老问题，情况也类似。为了解决这些问题，引出了碱基切除、核苷酸切除和DNA错配修复途径背后的分子机制。[3] 这些发现是生物学研究的重要进展，使得该研究的先驱Tomas Lindahl、Paul Modrich和Aziz Sancar获得2015年诺贝尔化学奖。[4]

类似于上述例子，对基础生物学问题的研究使得我们发现了大量DNA/RNA聚合酶、核酸酶、连接酶等，统称为修饰酶。从这些修饰酶的最初发现开始，积累了大量关于修饰体系的知识和数据，推动了诸多额外的创新。

以下让我们来看看修饰酶在一些生物学前沿研究中的应用。

1

修复FFPE诱导的DNA损伤，

以便进行更准确的NGS测序

FFPE组织样本是常见的生物学样本类型，常用于肿瘤或免疫学临床前或临床应用中。获取组织样本后，将其保存于福尔马林中并通过石蜡进行包埋，可以半永久的形式保存生物分子及原始3-D细胞结构。FFPE样本可保存数十年，后续用于免疫组化（IHC）或其它显微观察分析。[5]

如今为了收集更丰富的基因组和转录组信息，越来越多FFPE样本被用于NGS测序中。其中最大的挑战是FFPE处理会给核酸分子带来损伤，包括交联（DNA和DNA之间，或者DNA和蛋白之间）、片段化、单核苷酸多态性（SNP）及脱嘌呤。这些损伤会随着时间逐渐累积，尤其是当样本处于非最佳存储条件下。福尔马林处理带来的DNA损伤极大地降低了DNA测序的质量，不管是从FFPE样本中提取的哺乳动物DNA还是细菌DNA。[6,7]

为了解决这个问题，研究人员利用体外再造的DNA修复系统来模拟体内进程（图1）。比如，胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶是FFPE样本的普遍现象，造成明显且不可复制的测序假象。使用尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG，可从双链或单链DNA中高效高特异性地去除尿嘧啶，作为碱基切除修复（BER）途径的一部分）对提取的DNA进行预处理，可显著降低测序假象出现的频率。[3,8,9] 对于其它更广范围的DNA损伤，如碱基修饰、切刻、缺失等，已经开发出更复杂的DNA修复酶来修复这些损伤。这些修复酶的广泛应用可降低G:C到A:T突变的数量，增强单核苷酸多态性（SNP）和拷贝数变异（CNV）的检出率。[10,11]

图1. DNA中的错误碱基被UDG酶切除，形成一个无嘧啶碱基位点（AP位点）。核酸内切酶IV（Endo IV）水解脱碱基位点的5’端，形成含脱氧核糖磷酸（dRP）的单核苷酸缺口，之后多聚核苷酸激酶（PNK）可将dRP转化为磷酸基团（P），通过DNA Polymerase I 补齐并经T4 DNA连接酶完成连接。

许多研究团队重点关注哺乳动物基因组DNA的修复，但FFPE样本DNA损伤修复机制也可应用于FFPE样本的微生物群落分析。Bueso等最近发表的一篇文献证实，经FFPE处理后，在细菌DNA中会发生明显的DNA交联，且胞嘧啶的氧化和脱氨基是常见的DNA损伤形式。[12]

该研究团队同时开发出两种修复方法，一种用来修复DNA交联，一种包含再造的碱基切除修复（BER）机制。此体外BER反应使用3种糖基化酶（甲酰胺嘧啶-DNA糖基化酶（FPG）、Endo VIII和UDG）处理提取的DNA，紧接着分别使用Endo IV、PNK、DNA Polymerase I和E.coli DNA Ligase修复无嘌呤/嘧啶位点及封闭的末端。对修复的DNA进行全基因组测序，与未修复的DNA相比，去交联和体外碱基切除修复（BER）处理的结合可提高测序片段的长度、减少测序假象，增强整体的测序结果可读性。

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2

开发更灵敏的SARS-CoV-2诊断方法

随着SARS-CoV-2的持续流行及突变体的不断出现，开发灵敏及特异性的病原体诊断方法至关重要。基于RT-qPCR的方式已经成为病原体检测（尤其是针对SARS-CoV-2）的金标准，检测可针对特定突变体且可在感染早期阶段进行检测。

但RT-qPCR检测需要训练有素的检测人员及专业检测实验室，所需检测时间较长且需要昂贵的检测设备。所以对更加方便、易于使用的即时诊断（POCT）需求越来越大。

核酸等温扩增技术即为一种潜在的选择，其无需热循环仪及专业操作知识。在众多已出现的等温扩增反应类型中，依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）具有更广的临床应用潜能，可广泛应用于细菌、病毒、真菌和原核病原体的检测。[13,14] NASBA方法可在单管反应中检测病原体RNA，反应体系中包含反转录酶（合成第一链和第二链DNA并引入T7启动子序列）、RNase H（特异性切割RNA/DNA杂合链中的RNA）以及T7 RNA聚合酶（T7 RNAP，转录扩增反义RNA）。基于T7 RNA聚合酶的扩增速度快（30分钟内完成）且产量高，可获得高达1012扩增子。[14,15] 经扩增的RNA之后通过结合荧光分子信标探针进行定量检测。

图2. NASBA流程示意图。

最近，一种新的NASBA衍生技术，基于切刻和延伸链反应系统的扩增（NESBA）得以开发。该技术在T7 RNA聚合酶介导的RNA扩增前使用切刻内切酶进行一个切刻步骤，可实现DNA的指数扩增。加入切刻步骤可显著提高NASBA技术的灵敏度，使其可用于临床COVID-19检测。在临床环境中，NESBA 100%准确诊断出30例阳性和68例阴性，突显出其在POCT检测中的实用性。[15]

图3. 使用NESBA进行COVID-19诊断的大致流程。（a）COVID-19诊断流程。（b）SARS-CoV-2基因组图谱和NEBSA的目标区域。(c)用于靶标RNA检测的NESBA示意图。箭头表示核酸链的3 ''端。

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3

环状RNA研究，以进行mRNA疫苗开发

Pfizer/BioNTech和Moderna SARS-CoV-2疫苗的成功开发和应用使得mRNA疫苗受到广泛关注，是针对新型病原体的一种快速高效的应对策略。由于目前mRNA疫苗的生成和配送还存在一些局限性，需要超低温存储且疫苗保质期相对较短（至多6个月），所以如何改进现有的mRNA疫苗设计是疫苗开发人员的重要关注点[16]。

为了解决mRNA疫苗稳定性问题，提出了多种可能的解决方案，其中之一就是将mRNA疫苗设计成环状RNA（circRNA），而非线性RNA [17]。环状RNA作为一种micro RNA（miRNA）或蛋白海绵、蛋白复合物的支架和蛋白合成模板，在哺乳动物细胞的正常功能中发挥着重要作用，因此收到越来越多的关注。circRNA的生物工程改造也持续增加，包括内部核糖体进入位点（IRES）驱动异源蛋白的体内和体外生产。circRNA的稳定性是线性RNA的2-5倍，这进一步支持其在新型疫苗中的潜在应用。

circRNA的生物合成途径是一种准确高效的circRNA生产方法（图2）[17]。该方法通过T7 RNA聚合酶介导的体外转录生成线性RNA前体，接着进行磷酸化处理去除5’端三磷酸，以及通过PNK处理加上5’端单磷酸。5 ''单磷酸和3 ''羟基的存在便可使用T4 DNA连接酶或T4 RNA连接酶形成环状RNA。单链cDNA寡核苷酸可发挥桥接作用，将5 ''端和3 ''端在空间上连接在一起，从而提高连接效率。虽然最近发表了一篇概念验证论文，证实了circRNA疫苗的功效，但生物制药公司尚未进行全面的商业应用[18]。

图4. 体外转录流程生成circRNA，源于Obi et al. [19] （a）T7 RNA聚合酶介导的体外转录双链DNA模板可通过PCR或质粒酶切获得。（b）将DNA模板和T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、核糖核苷酸三磷酸（rNTP）共同孵育开启体外合成。（c）环化所需的5’单磷酸可通过在rNTP混合物中使用超量的GMP来生成，紧接着使用碱性磷酸酶（d）和PNK酶（e）处理，或者焦磷酸酶（RppH）处理。（f）得到的5’单磷酸化RNA可与T4 RNA连接酶共同孵育进行环化。

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参考文献(向上滑动)：

1. Losick R. In vitro transcription. Annu Rev Biochem. 1972;41:409-446. doi:10.1146/annurev.bi.41.070172.002205 

2. The Science Behind the Shot: Biotech Tools Developed at Brookhaven Lab Fundamental to Making COVID-19 Vaccines. Brookhaven National Laboratory website: https://www.bnl.gov/newsroom/news.php?a=218806. Accessed April 6, 2022. Published April 13, 2021. 

3. Lindahl T. DNA repair enzymes. Annu Rev Biochem. 1982;51:61-87. doi:10.1146/annurev.bi.51.070182.000425 

4. The Nobel Prize in Chemistry 2015. The Nobel Prize website: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2015/summary/. Accessed April 6, 2022. Published October 7, 2015. 

5. Kokkat TJ, Patel MS, McGarvey D, LiVolsi VA, Baloch ZW. Archived formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) blocks: A valuable underexploited resource for extraction of DNA, RNA, and protein.Biopreserv Biobank. 2013;11(2):101-106. doi:10.1089/bio.2012.0052 

6. Do H, Dobrovic A. Sequence artifacts in DNA from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clin Chem. 2015;61(1):64-71. doi:10.1373/clinchem.2014.223040 

7. Flores Bueso Y, Walker SP, Tangney M. Characterization of FFPE-induced bacterial DNA damage and development of a repair method. Biol Methods Protoc. 2020;5(1):bpaa015. doi:10.1093/biomethods/bpaa015 

8. Do H, Dobrovic A. Dramatic reduction of sequence artefacts from DNA isolated from formalin-fixed cancer biopsies by treatment with uracil- DNA glycosylase. Oncotarget. 2012;3(5):546-558. doi:10.18632/oncotarget.503 

9. Slupphaug G, Mol CD, Kavli B, Arvai AS, Krokan HE, Tainer JA. A nucleotide-flipping mechanism from the structure of human uracil-DNA glycosylase bound to DNA. Nature. 1996;384(6604):87-92. doi:10.1038/384087a0 

10. Hosein AN, Song S, McCart Reed AE, et al. Evaluating the repair of DNA derived from formalin-fixed paraffin-embedded tissues prior to genomic profiling by SNP-CGH analysis. Lab Invest. 2013;93(6):701-710. doi:10.1038/labinvest.2013.54 

11. Lie P, Chen L, Ettwiller L, et al. Repair of challenging FFPE DNA improves library success rate and sequencing quality. In: Proceedings of the 106th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; April 18-22, 2015; Philadelphia, PA. Abstract 4886 

12. Flores Bueso Y, Walker SP, Tangney M. Characterization of FFPE-induced bacterial DNA damage and development of a repair method. Biol Methods Protoc. 2020;5(1):bpaa015. doi:10.1093/biomethods/bpaa015 

13. Compton J. Nucleic acid sequence-based amplification. Nature. 1991;350(6313):91-92. doi:10.1038/350091a0 

14. Wang Y, Yang M, Xia Y, Yan J, Zou J, Zhang D. Application and evaluation of nucleic acid sequence-based amplification, PCR and cryptococcal antigen test for diagnosis of cryptococcosis. BMC Infect Dis. 2021;21(1):1020. doi:10.1186/s12879-021-06678-4 

15. Ju Y, Kim J, Park Y, et al. Rapid and accurate clinical testing for COVID-19 by nicking and extension chain reaction system-based amplification (NESBA). Biosens Bioelectron. 2022;196:113689. doi:10.1016/j.bios.2021.113689 

16. Uddin MN, Roni MA. Challenges of Storage and Stability of mRNA-Based COVID-19 Vaccines. Vaccines (Basel). 2021;9(9):1033. doi:10.3390/vaccines9091033 

17. Chen X, Lu Y. Circular RNA: Biosynthesis in vitro. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9:787881. doi:10.3389/fbioe.2021.787881 

18. Qu L, Yi Z, Shen Y et al. Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants. bioRxiv. 2022;03.16.435594. https://doi.org/10.1101/2021.03.16.435594 

19. Obi P, Chen YG. The design and synthesis of circular RNAs. Methods. 2021;196:85-103. doi:10.1016/j.ymeth.2021.02.020