热点应用丨ATR-FTIR技术在生物液体--人类血清白蛋白研究中的应用

2023-06-16 10:56:26 天美仪拓实验室设备（上海）有限公司

衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)是分析生物流体的一种理想技术。红外光谱记录分子键振动，可以获得生物样品的红外指纹图谱。医疗保健研究人员和临床医生关注“液体活检”（一种微创的样本收集方法）。许多生物液体，如尿液、唾液和血液，可以使用ATR-FTIR进行研究。利用生物液体样品之间的光谱差异，可以区分健康患者和患病患者。

血液是医学诊断中应用最广泛的生物液体，它由血浆、红细胞、白细胞和血小板组成。对于光谱分析，通常使用血浆或血清，因为这两种液体可以冷冻保存。血液的冷冻过程会导致细胞破坏，血红蛋白对光谱信号影响很大。血浆是在抗凝管中离心分离的水溶液，而血清是通过血液凝固分离血细胞和血小板得到的，如图1。血清更常用，因为血清的制备方法可以有效地去除红细胞。

图1 血浆和血清

ATR-FTIR技术在中红外区域（4000cm^-1~400cm^-1）检测生物样品（如蛋白质、脂质和氨基酸）中功能基团的基本振动，仅需要几微升的小样本量，即可提供快速的结果；同时也是一种节约成本、易于使用的诊断方法。ATR-FTIR技术进行血清分析已用于许多疾病研究，如癌症、子宫内膜异位症、脑部疾病和病毒感染^1~6。

水对生物液体测试的影响

ATR-FTIR技术在进行生物液体样品分析时，水会对红外光谱的产生影响，图2。水的极性很强，会产生强烈的红外响应；当使用ATR-FTIR分析生物流体样品时，水的红外光谱掩盖了样品中的生物信息。通常，在检测生物液体时，测试者必须等待样品干燥；这很耗时，并延长了总测试时间。更快的方法是使用加热ATR附件。通过加热样品，水分蒸发得更快，总测试时间显著减少。本文使用加热ATR附件的IR5红外光谱仪，去除水分并快速测量血清样本的光谱。

图2 红外光谱中的水峰

实验设备及方法

配有加热ATR附件的爱丁堡IR5傅里叶变换红外光谱仪，测量人类血清白蛋白样本。ATR的反射晶体选择金刚石材质（高折射率和耐用性）。由于其优异的导热性，金刚石ATR附件适合于加热实验。

图3 IR5傅里叶变换红外光谱仪（a）和ATR加热附件（b）

为了验证加热ATR附件对干燥时间的影响，将3μL样品移液到ATR上，不加热ATR采集光谱。ATR预热并保持在50℃恒定，重复此过程。红外光谱的分辨率设置为4cm^-1，扫描10次，每个光谱的总测试时间为35秒。

结果与讨论

人血清白蛋白在室温下干燥2分钟(蓝色)和ATR加热(红色)的红外光谱，如图4所示。在室温ATR测量中，光谱以水的吸收峰为主，生物光谱信息被覆盖。使用加热ATR可获得无水干扰的完整生物光谱。如果将蓝色光谱样品在室温下干燥，需要超过15分钟的干燥时间，生物光谱才能充分显示，这大大降低了测量通量。

图4 人类血清白蛋白的ATR-FTIR光谱图

（蓝色：室温下干燥2分钟；红色：加热至50℃干燥）

ATR-FTIR提供了生物液体样品中生物成分的重要信息，图5给出了血清样本光谱的波段分布。红外生物光谱分布在两个区域：从2600cm^-1到3800cm^-1的高波数区域，以及由双键拉伸和指纹区组成的2000cm^-1到500cm^-1的低波数区域。低波数区域提供具鉴别性的数据，也是最常用于诊断的区域⁷。

图5 人类血清白蛋白的红外光谱波段分布

结论

本文通过血清样本的生物指纹图谱测试，表明IR5对生物液体分析的高灵敏度。IR5傅里叶变换红外光谱仪配备加热ATR附件，克服了样品含水的问题。使用加热ATR附件，在不降低光谱质量的情况下，使光谱采集所需的干燥时间大大缩短。

参考文献

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5.K. Naseer et al., “ATR-FTIR spectroscopy as the future of diagnostics: a systematic review of the approach using bio-fluids,” Appl. Spectrosc. Rev., vol. 56, no. 2, pp. 85–97, 2021.

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7.A. Rohman et al., “The use of FTIR and Raman spectroscopy in combination with chemometrics for analysis of biomolecules in biomedical fluids: A review,” Biomed. Spectrosc. Imaging, vol. 8, no. 3–4, pp. 55–71, 2019.

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