Circulation丨S-硫巯基化修饰在主动脉瘤/夹层中的关键作用

2023-05-10 17:18:35, 景杰生物杭州景杰生物科技股份有限公司

景杰生物 | 报道

主动脉瘤和主动脉夹层（Aortic aneurysm and aortic dissection，AAD）是严重危害患者生命健康的大血管病变。AAD的发病机制十分复杂，多项研究均表明内皮细胞功能紊乱是疾病发生发展的关键。因此，探究主动脉瘤和主动脉夹层疾病过程中内皮细胞功能稳态机制有助于发现潜在治疗靶点。

半胱氨酸氧化还原修饰能够可逆地调节蛋白质活性、互作以及定位，进而精密调控多种生命活动。硫化氢（H2S）是维持血管稳态的重要气体信号分子，参与了多种细胞功能，其介导的蛋白质S-硫巯基化（S-sulfhydration）属于半胱氨酸氧化还原修饰的一种。季勇教授团队前期围绕着蛋白质S-硫巯基化进行了系统的描述[1]。胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）催化H2S生成，对内皮细胞稳态至关重要。然而，蛋白质S-硫巯基化在内皮细胞稳态及主动脉瘤和主动脉夹层中的作用尚不明确。

近日，南京医科大学季勇，谢利平，韩艺及美国天普大学Wang Hong合作在心血管领域权威期刊Circulation （IF=39.918）在线发表了题为“Endothelial HDAC1-ZEB2-NuRD Complex Drives Aortic Aneurysm and Dissection Through Regulation of Protein S-Sulfhydration”的研究成果。研究者进行了主动脉瘤和主动脉夹层患者内皮细胞硫巯基化修饰组学检测，发现胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氢体系（CSE/H2S）介导的蛋白质巯基硫化修饰在内皮功能稳态及AAD中发挥保护作用，并发现了HDAC1-ZEB2-NuRD（组蛋白去乙酰化酶1-锌指电子盒绑定同源盒2-核小体重构和脱乙酰酶）复合体介导胱硫醚-γ-裂解酶表达。此外，该研究还发现了对AAD有潜在治疗作用的候选药物分子，为AAD的防治提供了新的思路。

研究首先收集了99名主动脉夹层（Aortic dissection，AoD）患者和健康对照组的血浆样本，并检测了两组血浆中的H2S浓度，发现主动脉夹层患者的血浆H2S浓度显著低于健康对照组（图1A）。校正关键临床特征（例如年龄、性别、吸烟史、高血压等）后，各组之间血浆H2S的水平仍存在差异（图1B）。

图1 AoD患者的血浆H2S浓度显著低于健康对照组

研究者对健康对照组和腹主动脉瘤（Abdominal aortic aneurysm，AAA）患者主动脉血管样本进行了转录组分析，发现AAA患者血管CTH的mRNA水平降低（图2A）。通过泵皮下给药Ang II的方式诱导ApoE-/-小鼠构建了小鼠AAD模型，发现这些发病小鼠的血浆H2S浓度显著下降（图2C）。荧光染色结果也表明给予Ang II后，血管内皮细胞中CSE的表达量减少（图2D）。在人和小鼠的内皮细胞培养过程中，血管紧张素II的孵育导致CSE mRNA和蛋白质水平随时间变化而呈现浓度依赖性减少（图2E和图2F）。

图2 胱硫醚γ裂解酶/硫化氢系统在主动脉瘤和夹层患者、主动脉瘤内皮和夹层小鼠中的功能障碍

为了探究内皮CSE在AAD进展中的作用，研究人员构建了内皮细胞特异性CSE敲除小鼠（CSEΔEC小鼠），并皮下输注Ang II诱导AAD（图3A）。监测发现Ang II治疗增加了两种基因型小鼠（CSEf/f和CSEΔEC）的收缩压（图3B）。Ang II处理后，15只CSEΔEC小鼠中有9只小鼠出现AAD（图3C和3D）。超声成像也显示出CSEΔEC+AngⅡ小鼠的腹主动脉直径显著增加（图3E）。与CSEf/f+AngⅡ小鼠相比，CSEΔEC+Ang II小鼠的主动脉与体重之比显著增加（图3F），CSEΔEC+Ang II小鼠的弹性纤维断裂也更严重（图3G）。通过原位酶谱法，发现CSEΔEC小鼠肾上主动脉中基质金属蛋白酶的活性显著增加（图3H）。以上结果表明，内皮CSE的敲除会加速AAD的发展。

图3 内皮胱硫醚γ裂解酶（CSE）缺乏加重主动脉瘤和主动脉夹层

进一步地，为了探索蛋白质S-硫巯基化修饰在AAD过程中的调控作用，利用Tag-switch技术、质谱分析、生物信息学分析和特异性半胱氨酸位点突变等多种技术，研究人员发现，H2S介导的蛋白质二硫键异构酶（PDI）的硫巯基化修饰在维持内皮功能稳态中起着至关重要的作用。其主要调控机制为H2S通过促进PDI在半胱氨酸343和400位点的硫巯基化修饰，提高其还原酶活性和底物结合活性，从而发挥其主要调控作用。该位点修饰功能表现为可以对抗内质网应激，维持内皮功能的稳态。

图4 内皮中PDI S-硫巯基化修饰的减少增强了内皮内质网应激

确认内皮CSE参与AAD过程中PDI-SSH的调节后，研究进一步探究CSE/H2S失活的上游机制。根据转录组结果，CTH（CSE编码基因）mRNA水平下降可能是由于转录抑制引起。通过基于iTRAQ的蛋白质组学分析主动脉夹层患者和健康对照主动脉血管样本中差异蛋白表达情况，GSEA分析转录调控相关功能基因富集情况，最终发现HDAC1极有可能是抑制CTH转录的关键调控因子。并且，利用蛋白组、WB、染色等手段均验证了在AAD相关细胞、动物及临床样本中发现HDAC1的表达水平升高。

图5 在ADD发展过程中，HDAC1的表达水平升高

接着，利用CoIP联合质谱检测分析及蛋白互作网络分析来鉴定与HDAC1相互作用的蛋白质，最终发现NuRD复合物及转录抑制因子ZEB2可能与HDAC1共同调控CTH的表达。研究人员进一步应用CoIP、ChIP以及报告基因截短的方法，确定HDAC1-ZEB2-NuRD复合物与CTH启动子上游的AGGTG元件结合，从而介导了其转录抑制作用。为了确定HDAC1是否降低CSE的表达并最终在体内诱导AAD，研究人员构建了ApoE-/-背景的内皮特异性HDAC1敲除小鼠。并通过一系列实验验证了敲除内皮细胞中的HDAC1降低了AAAs和致死性AoD，同时敲除CSE逆转了这种保护作用。这些数据说明内皮细胞HDAC1的升高通过减少CSE的表达而加重AAD。

图6 ZEB2招募HDAC1-NuRD复合物抑制胱氨酸γ裂解酶的表达

最后，研究人员探索了H2S缓释供体GYY4137和HDAC1抑制剂恩替诺特（Entinostat）对小鼠AAD进展的影响。发现GYY4137和恩替诺特均对AAD进展起到了保护作用，显著降低了AAD发生率、改善内皮依赖的血管舒张同时提高内皮细胞中cGMP水平。

图7 GYY4137和恩替诺特均可缓解AAD

综上所述，这项研究揭示了CSE/H2S体系介导的蛋白质S-硫巯基化修饰在内皮功能稳态及AAD中发挥核心的保护作用，并且发现了HDAC1-ZEB2-NuRD复合体介导CSE表达的表观调控新机制。另一方面，研究针对这一通路的关键药物靶标进行了研究，发现GYY4137和恩替诺特对ADD有防治作用，为ADD疾病的治疗提供了潜在的治疗候选药物。

编者按：蛋白质氧化还原修饰是一种非常重要的蛋白质修饰方式，它能够通过改变蛋白质的氧化还原状态，调节蛋白质的结构和功能，从而参与细胞的正常生理过程和疾病。分析蛋白质半胱氨酸对氧化还原扰动的反应，对于理解潜在机制至关重要。景杰生物作为修饰组学领域的领跑者，提供的基于质谱的半胱氨酸氧化还原修饰组学（整体氧化还原修饰、S-亚硝基化修饰、S-谷胱甘肽化修饰、S-次磺酸化修饰、S-硫巯基化修饰等）可以对修饰蛋白和位点进行定性、定量和功能分析，具有高通量、更精确、更全面、更新颖等优势，合作文章发表在Nature Communications，Plant Communications等权威期刊。如果您对半胱氨酸氧化修饰组学感兴趣，可联系景杰生物当地销售工程师或拨打科服热线 (400-100-1145) 咨询。

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参考文献

1. Luo S, et al. 2023.Protein persulfidation: Recent progress and future directions. Antioxid Redox Signal.

2. Luo S, et al. 2023. Endothelial HDAC1-ZEB2-NuRD Complex Drives Aortic Aneurysm and Dissection Through Regulation of Protein S-Sulfhydration. Circulation.

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