【基因编辑】主打精确高效！CRISPR再创细胞治疗“新范式”

CRISPR/Cas9的核心部分包括具有向导功能的sgRNA和行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白。利用CRISPR/Cas9对细胞进行改造主要可以分为两种：一种是针对干细胞；另一种则是针对免疫细胞，包括T细胞、NK细胞、TIL细胞等。

干细胞技术的发展已历经大半个世纪，在近二十年来，诱导多能干细胞（iPSC）凭借着取材不限、不触及伦理道德问题、能够不断自我更新和多向分化等优点逐渐成为研发的一大热点。将iPSC与CRISPR/Cas9结合，能够有效纠正病人细胞中的遗传缺陷，是一个具有发展前景的方向，目前已有文献报道。

在一篇名为“High-Efficiency CRISPR/Cas9-Mediated Correction of a Homozygous Mutation in Achromatopsia-Patient-Derived iPSCs”的文章中，研究人员利用CRISPR/Cas9和TALENs技术纠正了患者hiPSC中的纯合PDE6C致病性变体，并证明了CRISPR/Cas9在基因编辑中的高效性。

研究人员通过CRISPR/Cas9进行了单链寡核苷酸（ssODN）介导的基因编辑，用核糖核蛋白（RNP）复合物转染FRIMOi007-A细胞，该复合物包括sgRNA、ssODN和Cas9-HiFi蛋白。在电穿孔和细胞生长后，研究人员筛选了近50个单克隆对PDE6C基因特定区域进行测序，对这些序列的准确分析表明，CRISPR/Cas9成功地进行了基因编辑，且具有显著的效果，有80%（36/45）的克隆表现出PDE6C序列校正。在36个被成功编辑的细胞中，有19个纯合变异、15个杂合变异以及2个半合子变异被纠正。

基因编辑存在的最大挑战之一就是脱靶效应，可能会在目标区域或非目标区域进行非预期的编辑。在进一步分析中，研究人员发现大多数成功编辑的克隆没有基因组异常的现象。同时，对hiPSC细胞生长和多能性的评估结果表明，CRISPR/Cas9介导的基因编辑可以有效精确校正单核苷酸突变，保留了hiPSC的多能性且在潜在的脱靶中未表现出基因组改变，具有治疗色盲（ACHM）的潜力。

在这项研究中，研究人员所使用的是赛默飞的Invitrogen™ TrueCut™ HiFi Cas9 高保真蛋白，这是一种兼具低脱靶效应与高靶向编辑效率的Cas9蛋白变体，能够显著降低包括常规细胞、原代细胞、干细胞和免疫细胞在内的多种细胞类型的脱靶效应，同时在靶向编辑效率上与野生型 TrueCut Cas9 v2持平。该产品是基于通过ISO 13485认证的质量管理体系生产的，质量稳定可靠。

▲ Invitrogen™ TrueCut™ Cas9 v2

另外，同样采用ISO 13485质量标准制造的还有Invitrogen™ TrueCut™ Cas9 v2 野生型Cas9蛋白，经测试能够在多种类型的细胞（包括原代细胞、干细胞和免疫细胞）中保持一致的高靶向编辑效率。即使是在困难靶点的编辑上，其编辑效率相较于传统Cas9蛋白而言高出2倍。

除了基因编辑干细胞，CRISPR/Cas9改造免疫细胞也是一大“重头戏”。目前，CAR-T、NK、TIL等众多细胞疗法在治疗癌症方面取得了令人振奋的成果，然而传统的利用病毒载体制备的细胞疗法存在成本较高、生产周期较长等问题。CRISPR/Cas平台有着价格低、灵活性高、多靶向等优势，与现有细胞疗法结合能够“取长补短”。

2022年8月，《Nature》上发表了一篇题为“Non-viral, specifically targeted CAR-T cells achieve high safety and efficacy in B-NHL”的论文。其中，研究人员研发了一种非病毒CRISPR/Cas9 CAR-T疗法，并展示了CRISPR/Cas9介导的非病毒，基因特异性靶向技术在细胞治疗中的巨大潜力。

研究人员在室温下将一种sgRNA和重组spCas9复合得到RNP，在复合物形成后，立即对RNPs进行电穿孔，用于构建非病毒、PD1敲除的增强CAR-T疗法，在临床前研究中显示出了更有效的消除肿瘤细胞的潜力。在治疗复发性/难治性侵袭性B细胞非霍奇金淋巴瘤（R/R B-NHL）的临床试验中（NCT04213469）中，8名接受治疗的患者中有87.5%达到完全缓解，且无严重不良事件。值得一提是，这些增强CAR-T即使在低输注剂量和低CAR细胞百分比下仍有效。增强CAR-T疗法结合了非病毒制造工艺和精确基因组编辑的优势，能够有效缩短制备时间和降低成产成本，具有良好的安全性和疗效。

▲ Gibco™ CTS™ TrueCut™ Cas9

成功利用CRISPR/Cas9构建CAR-T疗法并应用于临床试验，选择合适的Cas9至关重要。赛默飞专为细胞治疗临床生产开发了符合GMP生产要求的Cas9蛋白——Gibco™ CTS™ TrueCut™ Cas9，其在FDA注册的基地遵循21 CFR Part 820的原则进行生产，具有各类申报支持文件，促进从科研到临床的快速转化。不仅如此，该产品通过了更高标准、更广泛的安全测试（包括生物负载、内毒素、支原体、宿主残留核酸和蛋白质），并在所有测试细胞系中始终保持高性能，在T细胞中的编辑率高于90%，是用于基因编辑免疫细胞研究的一大“利器”，同时也满足了该行业不断提升的要求规范。

另外，利用CRISPR/Cas9改造其他类型免疫细胞的研究也正在开展。如“CRISPR- mediated TGFBR2 knockout renders human ovarian cancer tumor-infiltrating lymphocytes resistant to TGF-β signaling”一文中，研究人员通过电穿孔递送Cas9 RNP体系来敲除从卵巢癌患者中分离出的TIL细胞的TGFBR2基因，在四个独立的OvCa TIL样本中测试了五种不同gRNA的Cas9-RNP复合物，获得了59±6%至100±0%的基因组水平TGFBR2的敲除效率，且未有证据表明在基因组其他位置发生脱靶效应。据悉，这一试验使用了高保真Cas9变体，显著降低了脱靶的可能性。

CRISPR/Cas9广泛应用于细胞治疗领域正推动着这一赛道迈上新的台阶，衍生出通用型、非病毒、体内细胞疗法等一系列具有想象空间和前景的研发方向。未来，随着基因编辑和细胞治疗领域的发展，基于CRISPR/Cas9的细胞治疗的精准度和效率都得到提升，创新性研究开展也将更为频繁。

但当下CRISPR/Cas9还有诸多需要优化的地方，包括脱靶效应、编辑效率、递送等。赛默飞专门针对基因编辑领域开发了一整套端到端的全流程解决方案，涵盖了设计与构建、递送、细胞培养、检测与验证，助力“一站式”解决问题，达到事半功倍的效果。

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