专注细胞治疗，打造全流程解决方案

2023-04-26 11:29:54 德国赛多利斯集团

细胞治疗作为一种先进疗法，已是药企研发热门领域，也是投资热点。随着国内外细胞治疗产品陆续获批上市，细胞治疗步入高速发展期。从全球细胞治疗管线来看，在不同细胞治疗类别中，CAR-T细胞治疗仍是管线最多的种类，其2022年CAR-T在研管线，同比增长24%，基于NK的细胞治疗数量同比增长55%，除此之外的其他细胞治疗，如干细胞治疗、DC免疫细胞疗法等，2022年增长为129% （见下图）。

（图片来源：Nat Rev Drug Discov. 2022 Sep;21(9):631-632）

作为细胞治疗产品步入商业化时代关键环节，细胞治疗产品制备工艺相较其他药物更为复杂。下文以细胞治疗药物制备常用载体慢病毒载体生产工艺、CAR-T制备工艺、干细胞（例如iPSC与MSC）制备工艺为例，浅析细胞治疗工艺面临的挑战及其解决方案。

慢病毒载体生产工艺要点

1.质粒制备

质粒是生产慢病毒载体的起始材料，通常在重组大肠杆菌发酵过程中获取。与科研实验不同，产业化生产需要更加关注关键的工艺步骤，例如：细菌发酵中的供氧效率、碱裂解参数、质粒经过纯化后的HCP，HCD，内毒素含量与超螺旋比例等，这将直接影响到最终质粒的产量与质量。

CIM^®整体柱

2.细胞扩增

现如今被广泛使用的HEK293细胞贴壁培养技术，目前因慢病毒的产能不足，贴壁工艺应用到慢病毒载体大规模制备的话，仍不能很好的解决这个问题。此外，贴壁培养中添加的血清，需要在后续纯化过程中去除。而悬浮无血清细胞培养系统，使得慢病毒载体生产的工艺放大更为容易，可通过提高细胞的培养密度，提高慢病毒的产量，由于没有血清的添加也为慢病毒下游纯化减少了负担。

Ambr^® 15细胞培养系统

3.转染与病毒扩增

目前有多种质粒转染的方法，但都有各自的局限性。例如，利用磷酸钙进行的转染，其试剂纯度和pH敏感性会导致病毒载体生产在批次间存在显著差异，对于包装慢病毒的细胞有毒性，且转染效率低。脂质体转染效率相对较高且细胞毒性较低，但试剂费用较贵。目前病毒载体规模化生产中使用最广泛的转染试剂是聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI），其主要的优势是提高了质粒的转染效率。同时培养用的培养基与生物反应器对于提高病毒产量同样也有着重要的影响。

Biostat^®STR第三代系统

HEK细胞专用培养基

4.收获及澄清

一般在转染后48-72小时内，对慢病毒载体进行收获。澄清为的是从含有慢病毒的原始料液中去除细胞和细胞碎片等杂质。该步骤通常包括深层/深度过滤、切向流微滤、低速离心，或这些操作的组合。由于慢病毒载体的存在包膜结构，对剪切力敏感，且慢病毒载体的理化性质不稳定，对温度及pH等也敏感，因此澄清手段要温和，避免慢澄清过程中操作造成病毒的破碎与失活。在大规模生产时，还需要考虑设备使用前后的清洁消毒，因此使用一次性技术，可大大降低时间成本的投入，提高生产效率。

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5.载体的纯化

在澄清之后，慢病毒载体的纯化通常使用阴离子交换层析和/或切向流过滤(TFF)，慢病毒载体的纯化是慢病毒载体生产工艺的最大挑战。如上所述，慢病毒载体对剪切力敏感、理化性质不稳定，因此，下游工艺中的回收率通常较低，需要关注层析与超滤工艺的优化，确保收率的提升。

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TFF过滤膜包

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6.终端除菌及灌装

经过澄清与纯化后，获得慢病毒载体的原液，需要经过终端除菌降低微量微生物污染的威胁。除菌过滤后的灌装过程中需要严格按照法规对于无菌灌装的要求操作，以保证最终产品的无菌性、无热原、无可见异物、无可溶性微粒等。

Sartopore^®系列除菌过滤器

CAR-T制备工艺要点

1.将T细胞从患者的外周血单个核细胞（PBMC）中分离出来

CAR-T细胞的制备是以人作为供体进行细胞的采集，血液中的PBMC（外周血单个核细胞）是制备CAR-T产品的起始细胞材料。CAR-T产品制备的起始细胞原料的检测表征和质量质控（例如：检测支原体等污染物的检测、不同细胞类群占比的表征等），对于最终CAR-T细胞治疗产品的安全性及产品疗效，质量等都至关重要。特别强调的是因为细胞治疗产品的特殊性对于微生物检测结果的速度要求更快一些。

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2.T细胞的筛选富集和激活

由于PBMC中的其他细胞对后续T细胞的扩增、激活或转导造成干扰，因此需要进一步筛选富集T细胞。T细胞分选富集后，需要对其刺激促进T细胞激活，从而获得足够活化的T细胞，用于后续慢病毒转导，制备CAR-T细胞。

Incucyte^®实时活细胞分析系统

Biostat^®RM

摇摆式生物反应器

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3.对激活的T细胞进行基因修饰与CAR-T细胞的扩增

CAR-T工艺中多采用慢病毒进行目的基因的递送。为了要达到临床治疗所需要的细胞数量，大规模制备过程中，可在一次性生物反应器中进行CAR基因的转导以及T细胞的扩增。其中细胞培养基、培养持续时间、生物反应器的选择等因素会影响CAR-T细胞的扩增质量，过程中也需要检测，确认转导效果。

T细胞培养基

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4.CAR-T细胞治疗产品的质检，分装，冷藏或冻存

CAR-T产品的质控检测一般包括：细胞数量及细胞活率、细胞表型、CAR 阳性率检测、生物学效力检测，无菌检查、支原体、热原/内毒素的检测、CAR-T 细胞基因组中病毒载体拷贝数及整合的检测、RCR/RCL检测、工艺残留物检测（如具有潜在风险的磁珠残留、细胞因子残留、Retronectin残留等）及肿瘤细胞残留检测等。原则上应尽可能用最终CAR-T产品进行质量检测。

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此外，目前细胞治疗药物工艺中的很多步骤都已逐步实现了自动化及封闭式操作，但就工艺中的培养基、缓冲液等工艺液体分装而言，大多数细胞治疗产品生产或研发机构还在采用传统的人工分装方式，由于这种方式操作繁琐，且很多步骤都涉及到了开放式操作，耗时费力且易造成产品的污染，因此，工艺液体分装的自动化和封闭化很有必要。

Linkit®AX智能分装系统

iPSC & MSC制备工艺要点

1.细胞的采集与分离

细胞的采集要符合伦理要求，明确其来源，并对细胞做好质控。经过采集分离后的细胞，可进行高通量单细胞挑选，并进行单克隆成像验证，确保后续培养的细胞的单克隆源性。

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2.细胞的扩培

为了获得足够的治疗剂量，需要对干细胞进行扩培。干细胞扩培过程对于培养基及其添加物的要求较高，培养基及其添加物应有足够的纯度并符合质量标准。干细胞在培养过程中，随着代次的增加，易老化。为支撑干细胞较长期的培养，需对培养基的配方进行优化。此外，传统的贴壁培养或2D培养方式存在生产数量有限、人工成本高且无法有效实时监测细胞状态质量等缺点。因此，采用自动化生物反应器结合微载体培养技术也许是一种较佳的选择。

细胞培养基

Biostat^®RM

摇摆式生物反应器

Biostat^®STR

搅拌式生物反应器

3.细胞收获与质检

扩增后的细胞可通过离心方式进行收获，收获后需要检测细胞的细胞活力、生物学功能、致瘤性、微生物、内毒素含量等，以确保产品的质量，其中细胞活力、生物学功能对于产品的临床疗效至关重要，而致瘤性、包括支原体检测在内的微生物检测和内毒素检测等则和干细胞产品的安全性高度相关。

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Incucyte^®

实时活细胞分析系统

4.分装与保存

分装过程中，易造成细胞的污染，因此需要严格控制分装环境。细胞冻存液的使用及细胞储存条件要严格按照规范操作，以保证干细胞制剂稳定性及有效期。

赛多利斯作为一家为生命科学、生物制药等领域提供创新的实验室产品和服务以及生物制药设备和一次性解决方案的公司，致力于帮助客户进一步提高实验室研发及生物制药生产效率。专注于细胞治疗领域，依靠多年深耕生物制品工艺的专业经验，可提端到端，一站式，多维度的全流程产品与服务。

参考文献

1. Ana Rosa Saez-Ibañez, Samik Upadhaya, Tanya Partridge, Monica Shah, Diego Correa and Jay Campbell. Landscape of cancer cell therapies: trends and real-world data. Nature Reviews Drug Discovery, 01 June 2022.

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