2023-04-24 10:31:04 上海安谱实验科技股份有限公司
(图片源自摄图网)
硝基呋喃类药物(nitrofurans)广泛用于家禽、家畜、水产、蜂等动物传染病的预防与治疗,常见的硝基呋喃药物包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因,硝呋索尔也是一种硝基呋喃类抗菌药物,其结构和性质与呋喃唑酮等其它硝基呋喃类药物相似,原药在动物组织中代谢快速,生成代谢产物 3,5-二硝基水杨酸肼(3,5-Dinitrosalicylic acid hydrazide,DNSAH)和 5-硝基-2-糠酸,此类代谢产物在动物体内能与蛋白紧密结合,形成稳定的结合态残留物,可在体内存在相当长时间,具有一定的毒性。
根据欧盟 (EU ) 2019/1871 法规要求,自2022年11月28日起,动物源性食品需符合硝基呋喃代谢物 (增加硝呋索尔代谢物,共5种) 测定限值 0.5μg/kg的要求。海关总署也发函要求输欧盟养殖水产品、禽肉制品、蜂产品等动物源食品要批批检测硝基呋喃(含硝呋索尔)。
安谱实验参照《食品安全国家标准 水产品中硝呋索尔代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》征求意见稿,对方法进行适当优化,提供同时检测水产品中硝呋索尔、硝基呋喃代谢物残留量的完整应用解决方案。
标准溶液配制
标准品
硝呋索尔代谢物3,5-二硝基水杨酸肼(DNSAH),CDAA-S-300176-XA-1ml,100 mg/L于甲醇/水;
硝呋索尔代谢物内标3,5-二硝基水杨酸肼-15N2 (DNSAH-15N2),10 mg/L于甲醇,CDAA-S-300176N2-AL-1.2ml;
4种硝基呋喃类代谢物混标,CDAA-M-520005-AB-1ml,100 mg/L于甲醇;
4种硝基呋喃类代谢物内标混标,CDAA-M-520006-AA-1ml,100 mg/L于甲醇;
表1-1硝呋索尔、4种硝基呋喃类代谢物及内标基本信息
前处理操作
样品前处理
基质样品:鱼、虾
水解和衍生化:
取试料2g(精确±0.01g),于50mL离心管中,准确加入50 μL 4种硝基呋喃类代谢物内标工作液(0.1 µg/mL)和100 μL DNSAH内标工作液(0.1 µg/mL),涡旋混合1min,加0.5 mol/L盐酸溶液5 mL、0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液0.15mL,涡旋混合1min,置于恒温振荡器中,37 ℃避光振荡16h。
提取和净化:
用磷酸氢二钾溶液调 pH 至7.0 -7.5,加乙酸乙酯8mL,涡旋振荡10min,于4 ℃下10000 r/min 离心10min,取上清液至10mL玻璃离心管,40 ℃氮气吹干。加1.0mL定溶液(氨水乙腈溶液:移取35μL氨水,用10%乙腈水溶液稀释并定容至100 mL)溶解残留物,复溶液转移至15mL离心管中,4 ℃下13000r/min离心5min,过0.22µm PTFE滤器,待测。
注意事项
1、提取步骤离心条件改为在4℃,10 000 r/min离心10 min;
2、样品复溶除脂后若仍较浑浊,可低温冷冻后再离心过PTFE滤膜或使用超滤离心管;
3、过0.22μm PTFE针式滤器时建议过滤速度慢一些,只收集中间流出液200μL左右即可,使用内衬管上机进样,残留1/3左右的溶液在注射器中,这样可以保证样品相对清澈,如果全部过滤完则可能导致溶液浑浊。
4、硝呋索尔和4种硝基呋喃混标同时加标检测,最终复溶液为氨水乙腈溶液。
样品加标
①加标水平 0.5 μg/kg(对应上机溶液浓度 1 ng/mL):称取样品后,分别加入0.1 mL 0.01 μg/mL DNSAH标准工作液Ⅱ和0.01 μg/mL 4种硝基呋喃类代谢物标准工作液Ⅱ,后续操作同上;鱼肉基质和虾肉基质各2个平行样;
②加标水平 1.0 μg/kg(对应上机溶液浓度 2 ng/mL):称取样品后,分别加入0.2 mL 0.01 μg/mL DNSAH标准工作液Ⅱ和0.01 μg/mL 4种硝基呋喃类代谢物标准工作液Ⅱ,后续操作同上;鱼肉基质和虾肉基质各2个平行样;
③加标水平 5 μg/kg(对应上机溶液浓度 10 ng/mL):称取样品后,分别加入0.1 mL 0.1 μg/mL DNSAH标准工作液Ⅰ和0.1 μg/mL 4种硝基呋喃类代谢物标准工作液Ⅰ,后续操作同上;鱼肉基质和虾肉基质各2个平行样。
标准曲线
分别吸取0.01 µg/mL DNSAH 标准工作液和4种硝基呋喃类代谢物标准工作液各0.05mL、0.1mL、0.2 mL,0.1µg/mL 的 DNSAH 标准工作液和4种硝基呋喃类代谢物标准工作液各0.05mL、0.1mL于50 mL 离心管中,除不加基质样品外,其他操作同样品,得到浓度为0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、和10ng/mL的标准品。
仪器条件
液相色谱
a) Athena C18-WP 液相色谱柱(2.1mm*100mm,3μm,货号:LAEQ-211073);
b)柱温:30℃
c)流速:0.35mL/min
d)进样量:10 µL;
f)流动相:A:甲醇,B:2mmol/L乙酸铵溶液;
表3-1 液相色谱梯度洗脱条件
质谱条件-硝呋索尔
a)离子源喷雾电压(IS):-4500 V;
b)雾化温度(TEM):500℃;
c)气帘气压力(CUR):30 psi;
d)雾化气压力(GAS1):60psi;
e)加热辅助气(GAS2):65psi;
f)碰撞气流速比(CAD):8;
g) 其他参数见表3-2。
表3-2 硝呋索尔及其内标代谢物特征离子参考质谱条件
质谱条件-硝基呋喃
a)离子源喷雾电压(IS):4500 V;
b)雾化温度(TEM):550℃;
c)气帘气压力(CUR):30 psi;
d)雾化气压力(GAS1):60psi;
e)加热辅助气(GAS2):65psi;
f)碰撞气流速比(CAD):8;
g)其他参数参见表3-3。
表3-3 硝基呋喃类代谢物特征离子参考质谱条件
实验谱图
硝呋索尔实验谱图
图4-1 混合标准溶液谱图
(目标物及同位素内标浓度10ng/mL)
图4-2 鱼肉基质样品谱图
图4-3 鱼肉加标样品谱图(加标水平10ng/mL)
图4-4 虾肉基质样品谱图
图4-5 虾肉加标样品谱图(加标水平10ng/mL)
硝基呋喃实验谱图
AOZ
AOZ-D4
AMOZ
AMOZ-D5
AHD
AHD-13C3
SEM
SEM-13C,15N2
图4-6 混合标准溶液谱图(目标物及同位素内标浓度10ng/mL)
AOZ
AOZ-D4
AMOZ
AMOZ-D5
AHD
AHD-13C3
SEM
SEM-13C,15N2
图4-7 鱼肉基质样品谱图
AOZ
AOZ-D4
AMOZ
AMOZ-D5
AHD
AHD-13C3
SEM
SEM-13C,15N2
图4-8 鱼肉基质加标样品谱图(加标水平10ng/mL)
AOZ
AOZ-D4
AMOZ
AMOZ-D5
AHD
AHD-13C3
SEM
SEM-13C,15N2
图4-9 虾肉基质样品谱图
AOZ
AOZ-D4
AMOZ
AMOZ-D5
AHD
AHD-13C3
SEM
SEM-13C,15N2
图4-10 虾肉基质加标样品谱图(加标水平10ng/mL)
实验数据
标准曲线
表5-1 硝呋索尔及4种硝基呋喃代谢物标准曲线
加标回收率数据
表5-2 鱼肉基质加标回收率数据
表5-3 虾肉基质加标回收率数据
实验结论
优化后的方法,硝呋索尔及4种硝基呋喃代谢物标准曲线线性方程R2 > 0.995,线性良好。鱼肉、虾肉基质3个加标水平加标回收率在80%-120%之间,加标回收率良好。能够满足实验要求。
实验耗材
推荐货号 | 名称 | 规格 |
LAEQ-211073 | Athena C18-WP 液相色谱柱 | 2.1*100mm,3um |
LAEQ-211070 | Athena C18 液相色谱柱 | 2.1*100mm,3um |
CAEQ-4-000306-4000 | LC-MS级甲醇 | 4L |
CAEQ-4-000308-4000 | LC-MS级乙腈 | 4L |
CAEQ-4-014048-4000 | HPLC级乙酸乙酯 | 4L |
CAEQ-4-011516-4000 | HPLC级正己烷;99% | 4L |
CFEQ-4-110029-2500 | (易制毒三类)盐酸;36-38%,30多项金属元素杂质ppm级别 | 2.5L |
CAEQ-4-019966-0100 | HPLC级磷酸氢二钾,≥98.0% | 100g |
CFEQ-4-120036-0025 | 2-硝基苯甲醛(邻硝基苯甲醛);≥98.0% | 25g |
CAEQ-4-010734-4000 | HPLC级二甲基亚砜,DMSO | 4L |
CAEQ-4-000314-0050 | LC-MS级乙酸铵;≥99.0% | 50G |
CAEQ-4-000310-0050 | LC-MS级氨水,20~22%(NH3) | 50ml |
CDAA-300176-100mg | 硝呋索尔代谢物DNSAH(3,5-二硝基水杨酸肼) | 100mg |
CDAA-S-300176-JA-1.2ml | 硝呋索尔代谢物DNSAH(3,5-二硝基水杨酸肼) | 100mg/L于乙腈,1.2ml |
CDAA-300176N2-1mg | DNSAH(3,5-二硝基水杨酸肼)-15N2 | 1mg |
CDAA-S-300176N2-AA-1.2ml | 3,5-二硝基水杨酸肼-15N2(DNSAH-15N2) | 100mg/L于甲醇,1.2ml |
CDAA-S-300176N2-AL-1.2ml | 3,5-二硝基水杨酸肼-15N2(DNSAH-15N2) | 10mg/L于甲醇,1.2ml |
CDAA-M-520005-AB-1ml | 4种硝基呋喃类代谢物混标 | 100mg/L于甲醇,1ml |
CDAA-M-520006-AA-1ml | 4种硝基呋喃类代谢物内标混标 | 100mg/L于甲醇,1ml |
CDAA-S-520001-AA-1.2ml | 呋喃唑酮代谢物,AOZ | 100mg/L于甲醇,1.2ml |
CDAA-S-520002-AA-1.2ml | 呋喃它酮代谢物,AMOZ | 100mg/L于甲醇,1.2ml |
CDAA-S-520003S-AA-1ml | 呋喃西林代谢物盐酸盐,SEM盐酸盐 | 100mg/L于甲醇(非盐计),1ml |
CDAA-S-520004-AA-1ml | 呋喃妥因代谢物,AHD | 100mg/L于甲醇(非盐计),1ml |
CDAA-S-520001D4-AA-1.2ml | AOZ-D4( 呋喃唑酮代谢物内标) | 100mg/L于甲醇,1.2ml |
CDAA-S-520002D5-AA-1.2ml | AMOZ-D5(呋喃它酮代谢物内标) | 100mg/L于甲醇,1.2ml |
CDAA-S-520003CN-AA-1ml | SEM-13C,15N2(SCA-13C,15N2)(呋喃西林代谢物内标) | 100mg/L于甲醇,1ml |
CDAA-S-520004C-AA-1ml | 呋喃妥因代谢物-13C3(AHD-13C3) | 100mg/L于甲醇,1ml |
SCAA-104 | 有机相尼龙针式滤器(绿色) | 13 mm*0.22 μm,100只/罐 |
ABEQ-3300002-25 | CNW 50ml 尖底离心管 | 1袋,25/袋 |
ABEQ-3302006-25 | CNW 15mL尖底离心管 | 1袋,25/袋 |
EOAA-VM-B | 基本型漩涡混合器 | 转速0~2800rpm,周转直径4mm,运行模式:点动或连续 |
EOAA-HM-01 | 多管漩涡混合器(具有脉冲功能) | 转速500~2500rpm,振幅3.6mm,载重4.5kg |
EKMD-LAB124i | Luna 分析天平(内校) | 精度0.0001g 量程120g |
EKMD-LTB4602i | Luna 精密天平(内校) | 精度0.01g 量程4600g |
EULX-TDL-40B | B型低速台式离心机(变频电机电脑控制) | 4000rpm,水平式,100ml×4,50ml×8、15ml×16 |
EUOH-30314818 | FC5816R高速冷冻离心机 | 200–16000rpm,24325xg,Max6×250ml,温度-20~40℃ |
EFAA-DC24-RT | DC系列24位防腐型水浴氮吹仪 | RT+5~90℃,适配试管孔径10~29mm |
EIOH-30633239 | PH计套装AB33PH-F | 准确度1mV,0.01pH,0.5°C,标配电极ST310 |
上期回顾
水产品中硝呋索尔、硝基呋喃代谢物残留量测定的解决方案(一)——SN/T 4520-2016
官网|www.anpel.com.cn
云商|www.labsci.com.cn
热线电话|400-863-0099
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