2023-03-28 17:25:02 上海安谱实验科技股份有限公司
硝基呋喃类药物
(图片源自摄图网)
硝基呋喃类药物(nitrofurans)广泛用于家禽、家畜、水产、蜂等动物传染病的预防与治疗,常见的硝基呋喃药物包括呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃它酮和呋喃妥因,硝呋索尔也是一种硝基呋喃类抗菌药物,其结构和性质与呋喃唑酮等其它硝基呋喃类药物相似,原药在动物组织中代谢快速,生成代谢产物 3,5-二硝基水杨酸肼(3,5-Dinitrosalicylic acid hydrazide,DNSAH)和 5-硝基-2-糠酸,此类代谢产物在动物体内能与蛋白紧密结合,形成稳定的结合态残留物,可在体内存在相当长时间,具有一定的毒性。
根据欧盟 (EU ) 2019/1871 法规要求,自2022年11月28日起,动物源性食品需符合硝基呋喃代谢物 (增加硝呋索尔代谢物,共5种) 测定限值 0.5μg/kg的要求。海关总署也发函要求输欧盟养殖水产品、禽肉制品、蜂产品等动物源食品要批批检测硝基呋喃(含硝呋索尔)。安谱实验参照《SN/T 4520-2016 出口动物源食品中硝呋索尔代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》,对方法进行适当优化,提供同时检测水产品中硝呋索尔、硝基呋喃代谢物残留量的完整应用解决方案。
一、标准溶液配制
1
标准品
硝呋索尔代谢物3,5-二硝基水杨酸肼(DNSAH),CDAA-S-300176-XA-1ml,100 mg/L于甲醇/水;
硝呋索尔代谢物内标3,5-二硝基水杨酸肼-15N2 (DNSAH-15N2),10 mg/L于甲醇, CDAA-S-300176N2-AL-1.2ml;
4种硝基呋喃类代谢物混标,CDAA-M-520005-AB-1ml,100 mg/L于甲醇;
4种硝基呋喃类代谢物内标混标,CDAA-M-520006-AA-1ml,100 mg/L于甲醇。
表1-1硝呋索尔、4种硝基呋喃类代谢物及内标基本信息
二、前处理操作
1
样品前处理
基质样品:鱼、虾
水解和衍生化:
称取约2.00 g均匀试样(精确到0.01g)于50 mL塑料离心管中,加入0.1 mL DNSAH 内标工作液(0.1 µg/mL)、0.05 mL4种硝基呋喃类代谢物内标工作液(0.1 µg/mL),再依次加入10 mL水,0.5 mL 1 mol/L 盐酸溶液和500 μL 0.05mol/L 2-硝基苯甲醛溶液,涡旋混匀后置于37℃恒温振荡器中避光反应16 h。
提取和净化:
衍生后试样冷却至室温,加5 mL 0.1mol/L磷酸氢二钠溶液,用1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至7.0~7.5后,再加2.0g中性氧化铝(货号SBEQ-CA1801),摇匀1 min,在4℃,10 000 r/min离心10 min,上层清液转移至装有16 mL乙酸乙酯的50mL塑料离心管(铝箔纸避光)中,多管漩涡混合仪漩涡10min后,在4℃条件下,10 000 r/ min离心5 min,收集乙酸乙酯层,残留物用10 mL乙酸乙酯再提取一次,合并两次乙酸乙酯提取液。
提取液在40°C下氮吹干,残渣用1 mL定容液(2mmol/L乙酸铵溶液:乙腈=8:2)溶解,复溶后溶液转移至15mL离心管,再用2 mL乙腈饱和的正己烷液液萃取净化去脂。除去上层溶液后于4℃,13 000 r/min下离心5 min,使用玻璃巴斯德吸管小心吸取下层溶液过0.22 μm PTFE滤膜,待测。
注意事项
1、提取步骤离心条件改为在4℃,10 000 r/min离心10 min;
2、样品复溶除脂后若仍较浑浊,可低温冷冻后再离心过PTFE滤膜或使用超滤离心管;
3、过0.22μm PTFE针式滤器时建议过滤速度慢一些,只收集中间流出液200μL左右即可,使用内衬管上机进样,残留1/3左右的溶液在注射器中,这样可以保证样品相对清澈,如果全部过滤完则可能导致溶液浑浊。
4、硝呋索尔和4种硝基呋喃混标同时加标检测,最终复溶液为乙酸铵溶液:乙腈溶液。
2
样品加标
① 加标水平 0.5 μg/kg(对应上机溶液浓度 1 ng/mL):称取样品后,分别加入0.1 mL 0.01 μg/mL DNSAH标准工作液Ⅱ和0.01 μg/mL 4种硝基呋喃类代谢物标准工作液Ⅱ,后续操作同上;鱼肉基质和虾肉基质各2个平行样;
② 加标水平 1.0 μg/kg(对应上机溶液浓度 2 ng/mL):称取样品后,分别加入0.2 mL 0.01 μg/mL DNSAH标准工作液Ⅱ和0.01 μg/mL 4种硝基呋喃类代谢物标准工作液Ⅱ,后续操作同上;鱼肉基质和虾肉基质各2个平行样;
③ 加标水平 5 μg/kg(对应上机溶液浓度 10 ng/mL):称取样品后,分别加入0.1 mL 0.1 μg/mL DNSAH标准工作液Ⅰ和0.1 μg/mL 4种硝基呋喃类代谢物标准工作液Ⅰ,后续操作同上;鱼肉基质和虾肉基质各2个平行样。
3
标准曲线
分别吸取0.01 µg/mL DNSAH 标准工作液和4种硝基呋喃类代谢物标准工作液各0.05 mL、0.1mL、0.2 mL,0.1 µg/mL 的 DNSAH 标准工作液和4种硝基呋喃类代谢物标准工作液各0.05 mL、0.1 mL于50 mL 离心管中,除不加基质样品外,其他操作同样品,得到浓度为0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、和10ng/mL的标准品
三、仪器条件
1
液相色谱条件
a) Athena C18-WP 液相色谱柱(2.1mm*100mm,3μm,货号:LAEQ-211073);
b)柱温:30℃
c)流速:0.35mL/min
d)进样量:10 µL;
f)流动相:A:甲醇,B:2mmol/L乙酸铵溶液;
表3-1 液相色谱梯度洗脱条件
2
质谱条件-硝呋索尔
a)离子源喷雾电压(IS):-4500 V;
b)雾化温度(TEM):500℃;
c)气帘气压力(CUR):30 psi;
d)雾化气压力(GAS1):60psi;
e)加热辅助气(GAS2):65psi;
f)碰撞气流速比(CAD):8;
g) 其他参数见表3-2。
表3-2 硝呋索尔及其内标代谢物特征离子参考质谱条件
3
质谱条件-硝基呋喃
a)离子源喷雾电压(IS):4500 V;
b)雾化温度(TEM):550℃;
c)气帘气压力(CUR):30 psi;
d)雾化气压力(GAS1):60psi;
e)加热辅助气(GAS2):65psi;
f)碰撞气流速比(CAD):8;
g)其他参数参见表3-3。
表3-3 硝基呋喃类代谢物特征离子参考质谱条件
四、实验谱图
1
硝呋索尔实验谱图
图4-1 混合标准溶液谱图
(目标物及同位素内标浓度10ng/mL)
图4-2 鱼肉基质样品谱图
图4-3 鱼肉加标样品谱图(加标水平10ng/mL)
图4-4 虾肉基质样品谱图
图4-5 虾肉加标样品谱图(加标水平10ng/mL)
2
硝基呋喃实验谱图
图4-6 混合标准溶液谱图
(目标物浓度10ng/mL及同位素内标)
图4-7 鱼肉基质样品谱图
图4-8 鱼肉基质加标样品谱图(加标水平10ng/mL)
图4-9 虾肉基质样品谱图
图4-10 虾肉基质加标样品谱图(加标水平10ng/mL)
五、实验数据
1
标准曲线
表5-1 硝呋索尔及4种硝基呋喃代谢物标准曲线
2
加标回收率数据
表5-2 鱼肉基质加标回收率数据
表5-3 虾肉基质加标回收率数据
六、实验结论
优化后的方法,硝呋索尔及4种硝基呋喃代谢物标准曲线线性方程R2 > 0.995,线性良好。鱼肉、虾肉基质3个加标水平加标回收率在80%-120%之间,加标回收率良好。能够满足实验要求。
七、实验耗材
官网|www.anpel.com.cn
云商|www.labsci.com.cn
热线电话|400-863-0099
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