【赛默飞干细胞“飞”凡解读】之干细胞与心血管疾病篇

自从2012诺贝尔生理学或医学奖颁发给“体细胞重编程”技术以后，干细胞领域的研究直接被按下了“加速键”。赛默飞作为干细胞研究的支持者，希望帮助大家从不同的细分方向中获得新的启发，特别推出赛默飞干细胞“飞”凡解读活动，2023年4月-11月期间，小编将每月按不同主题给大家解读精品文献，包括干细胞与疾病、干细胞治疗、组织细胞再生、干细胞命运决定等话题，敬请期待！

本期将探讨干细胞在心血管疾病研究中的应用。心血管疾病仍然是全球死亡的主要原因，因此有越来越多的关于体外心血管组织模型构建的研究出现。而类器官在体外展现了仿真微观解剖结构和器官特定功能的潜力。为了被视为“类器官”，体外模型必须满足特定要求，包括：(1) 具有器官特异性细胞类型的 3D 多细胞组成，(2) 自组织和与起源组织的组织学相似性以及 (3) 展现至少一种与被建模器官相似的特殊生物学功能。

2022年发表在国际期刊 Scientific Reports 上的这篇研究 Generation and maturation of human iPSC‑derived 3D organotypic cardiac microtissues in long‑term culture 中，作者团队建立了一个实验方案来生成基于诱导多能干细胞 (iPSC) 的人类 3D 心脏微组织，这些微组织可以在无支架条件下形成，长时间培养，具有多种人类心脏细胞类型和自发原型组织，保持几个月的协调收缩活动，并对心脏活性药物产生功能性反应——特此称为 3D 人体器官型心脏微组织 (hOCMT)。

2D 到 3D 培养转换促进了无支架条件下的自发心脏微组织形成和长期培养中的原始组织形成。

由于诱导多能干细胞 (iPSC) 衍生的心肌细胞的2D单层分化在文献中得到了充分的验证，我们首先在 2D 系统中分化得到了人类 iPSC（以下简称 hiPSC），并测试它们是否可用于在没有任何外部 ECM 支架的情况下形成 3D 心脏聚集体。

如 Lian 等人先前所述，在没有胰岛素的情况下，可通过用小分子顺序调节 WNT 通路，在融合的 2D hiPSC 单层细胞中诱导心脏分化。首先，通过化学抑制糖原合成酶激酶3(GSK3)瞬时激活 WNT 来实现中胚层形成，然后通过抑制 WNT 棕榈油酰基转移酶 (PORCN)诱导心脏中胚层分化（图 1A）。因为在分化期间出现早期收缩心肌细胞后，细胞存活需要胰岛素，当观察到跳动的心肌细胞团时（第 7 天），将胰岛素添加到培养基中。在分化的第 15 天，单层细胞被解离成单个细胞并接种在圆底超低附着板上，在 ROCK 抑制剂存在的情况下诱导聚集体的自发形成（图 1A）。

将培养物从 2D 切换到 3D一天后，我们在光学显微镜下观察到一种无需任何 ECM 支架而自发形成 3D 微组织的趋势，48 小时去除 ROCK 抑制剂后开始显示自发跳动行为。为了监测这种自发的细胞组织，我们用表达GFP标记 的心肌肌钙蛋白 I (TNNI1) 报告基因的 hiPSC 中重复上述步骤生成微组织。正如预期的那样，我们观察到在微组织内出现了表达 GFP 的收缩性心肌细胞和非 GFP 标记的非心肌细胞。随着时间的变化，从第 21 天到第 42 天，GFP 标记的收缩性心肌细胞和非心肌细胞在微组织内逐渐自发地重新排列，从随机分布到更独立的成块区域（图 1B）。在没有任何外部 ECM 补充的情况下，微组织的直径在第 21 天达到 0.9 ± 0.04 毫米，在第 42 天达到 1 ± 0.09 毫米（图 1C）。微组织在长期培养中继续显示自发收缩活动，直到至少第 100 天。

2D 到 3D 培养转换促进了由多种心脏细胞类型组成的人类 iPSC 衍生的器官型心脏微组织的形成。

真正的类器官的关键特征之一是存在特定器官典型的不同细胞类型，以及它们在类似于建模器官的微观结构中自组织的能力。为了评估我们的 3D hOCMT 的细胞异质性，我们随着时间的推移量化了人类心脏中三个最具代表性的细胞群的存在：心肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞。

在分化的第 15 天（即微组织聚集的第一个时间点），心肌肌钙蛋白 T2 (TNNT2) 阳性细胞群的流式细胞术分析表明，除了不同的群体外，还分化为二维心肌细胞 (54.14 ± 9.08%) CD90 阳性非肌细胞 (28.87 ± 13.04%)。流式细胞术分析表明，与 2D 培养相比，3D 扩展培养与 TNNT2 阳性心肌细胞百分比的显着增加相关（3D 第 50 天：83.27 ± 9.45% vs 2D 第 50 天：27.23 ± 15,86%，p < 0.0001)（图 2B）。相反，2D 培养显示有利于 CD90 阳性细胞的过度生长（2D 第 50 天：52.97 ± 13.44% 对比 3D 第 50 天：23.38 ± 7.35%，p < 0.001）（图 2B）。虽然在任何 2D 培养时间点都观察到数量非常有限的 CD31 阳性细胞，但在 3D 培养期间表达内皮标记物 CD31 的细胞显着增加（3D 第 50 天：12.78 ± 2.71% vs 2D 第 50 天：4.07 ± 2.76%，p < 0.001）。

在这篇文献中，作者分享了非常详尽的实验方案，并培养出了在无支架条件下可以长时间培养的iPSC来源的人类 3D 心脏微组织，大家可以自行查询该文献更详细的了解研究方法和结果。其中，研究人员用到了许多赛默飞产品，包括Essential 8干细胞培养基，StemPro Accutase 细胞解离酶，RPMI 1640培养基，B27添加剂，血清替代物KSR，LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit等经典产品。

干细胞与心血管疾病研究好物推荐

Gibco™ Essential 8 培养基

货号：A1517001

成分最确定且一致性最高的iPSCs无滋养层培养基

相比传统的无滋养层培养基，差异更小

采用无外源成分且符合cGMP要求的培养基实现可靠且稳定的培养

支持50代以上的iPSC培养，并可维持iPSC向所有三个胚系谱系分化的能力

Invitrogen™ LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit（用于哺乳动物细胞）

货号：L3224

基于质膜完整性和酯酶活性的细胞活力检测试剂盒，可用于荧光显微镜（如上述文献中Fig.1D和Fig.8G）、流式细胞术和荧光酶标仪，与传统方法相比：

更快速

更安全

更灵敏

SuperScript™ IV 一步法 RT-PCR 系统

货号：12594100

具有出色的性能（灵敏度低至 0.01 pg RNA，靶标序列长度可达 13.8 kb）以及更快的一步法 RT-PCR方案

即便是对于纯度不佳的 RNA 样品，也可实现可靠的靶标检测

两相热启动活化机制可实现高特异性、高得率和室温配制反应体系

精准把握干细胞研究方向，快速高效开展实验已经成为干细胞研究的重要基础，而这一切在赛默飞提供的干细胞全流程研究解决方案中都能找到答案。除了上述这些科研好物，赛默飞干细胞全流程解决方案限时促销活动也在火热进行中！即日起起至6月30日，数千款赛默飞干细胞研究产品低至3折起，欢迎选购，上文提到的产品均有惊喜折扣！

查看干细胞全流程解决方案互动中心

一览限时大促好物👇🏻

参考文献（向上滑动查看更多）：

Ergir E, Oliver-De La Cruz J, Fernandes S, Cassani M, Niro F, Pereira-Sousa D, Vrbský J, Vinarský V, Perestrelo AR, Debellis D, Vadovičová N, Uldrijan S, Cavalieri F, Pagliari S, Redl H, Ertl P, Forte G. Generation and maturation of human iPSC-derived 3D organotypic cardiac microtissues in long-term culture. Sci Rep. 2022 Oct 18;12(1):17409. doi: 10.1038/s41598-022-22225-w. PMID: 36257968; PMCID: PMC9579206.