中重度症状新冠患者药物研发有新发现

前言：人类会感染上的冠状病毒通常都是较为温和的，但是少数会带来非常严重的临床症状，比如 2003 年的严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV），2012 年的中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和 2019 年开始至今仍在广泛流行的新型冠状病毒 SARS-CoV-2。感染 SARS-CoV-2 可能是无临床症状的，也可能引起明显的反应，轻微的例如上呼吸道感染，严重的会发展成肺炎甚至导致呼吸衰竭威胁生命。

近日，来自巴西圣保罗大学的 Dario S. Zamboni 团队在 Science Advances（2022 年 IF = 14.957）上发表文章，其通过高通量筛选的方式，在已知的 2560 种小分子化合物库中成功筛选出氯硝柳胺 Niclosamide（NIC），并发现 NIC 能有效抑制炎症小体的激活和 SARS-CoV-2 病毒的复制。该发现也为后续新冠药物的研发提供了理论支持。

首先该团队在实验设计上选用了嗜肺军团菌 Legionella pneumophila。嗜肺军团菌是一种常见的革兰氏阴性菌，能够触发多种炎症小体并形成细胞膜穿孔效应，是一种研究巨噬细胞中炎症小体激活作用的理想模型[1]。实验中向小鼠骨骨髓衍生巨噬细胞中分别添加 2560 种待筛选化合物各 10μM，添加嗜肺军团菌后用 PI 对细胞核进行染色并孵育 3 小时（Fig.1），以此来筛选 2560 种小分子化合物库中能抑制细胞膜穿孔效应的有效成分，最后初筛出 19 种小分子。随后分别测试各种化合物不同浓度下的穿孔效应抑制表现，有三种化合物脱颖而出，分别是 No.718 氯硝柳胺（NIC），No.802 单宁酸（TAC）和 No.816 氯氰碘柳胺（CLO）。其中，氯硝硫胺 NIC 对 caspase-1 的激活、IL-1β 的产生和含有半胱天冬酶-1 补充结构域的凋亡相关斑点样蛋白（ASC）的形成抑制效果最好，因此 NIC 被最终筛选出来进行下一步研究。

Fig.1 嗜肺军团菌 Legionella pneumophila 感染实验

随后的实验也分别证实，NIC 能够通过抑制炎症小体的激活和 SARS-CoV-2 病毒的复制来应对 SARS-CoV-2 的感染，因此最终该团队使用从 COVID-19 检测阳性的病人身上采集到的，炎症小体活跃的外周血单核细胞（PBMC）来测试 NIC 的实际效果。结果表明，相对于空白对照、TAC 和 CLO，NIC 对 PBMC 中的 Caspase 1 的抑制作用最为显著（Fig.2），对 NLRP3 炎症小体的抑制作用亦是如此（Fig.3）。

Fig.2 Caspase 1 活性实验

Fig.3 NLRP3 炎症小体抑制

小鼠感染模型的实验结果同样支持此结论。该团队使用 K18-hACE2 转基因小鼠，它能稳定的表达人血管紧张素转换酶 2（hACE2），这也是已被证实的 SARS-CoV-2 的功能性受体。在使用 2 × 104 RFU 的 SARS-CoV-2 病毒感染小鼠后，采用滴鼻注射 NIC 的小鼠肺部的炎症情况相对于对照组有非常显著的改善（Fig.4），但是遗憾的是使用该方法注射 NIC 无法阻碍病毒的复制。

Fig.4 NIC 能阻碍 SARS-CoV-2 感染小鼠的肺部炎症蔓延

综上所述

氯硝硫胺 NIC 作为一款使用了超过 50 年的药物，起初用来治疗绦虫感染，近年来的研究表明，NIC 同样能够在治疗感染性疾病时发挥作用。对于感染上 COVID-19，尤其是表现出中度甚至重度症状的人群而言，NIC 是一款潜在的有效药物，目前也已经有超过 20 个针对 NIC 的临床试验正在全球范围内开展[2]。但是值得一提的是，NIC 具有水溶性低，口服生物利用度差的问题[3]，如何利用其优点而规避其缺点是研究人员需要进一步考虑的课题。

在此研究中，该团队使用 Molecular Devices 公司的 SpectraMax i3x 多功能酶标仪，使用化学发光功能对 Caspase 1 活性进行检测，并使用了选配的 MiniMax 300 成像细胞计数仪进行 PI 染色后的细胞计数。除此之外，该团队还使用了 ImageXpress Micro XLS 高内涵成像系统（目前已升级为新一代 ImageXpress Micro 4 高内涵成像分析系统）进行细胞荧光信号的观察和拍摄。

参考文献：

[1]. D. P. Mascarenhas, D. S. Zamboni, Inflammasome biology taught by Legionella pneumophila. J. Leukoc. Biol. 101, 841–849 (2017).

[2]. ClinicalTrials.gov. (U.S. National Library of Medicine, 2022); https://clinicaltrials.gov

[3]. J. Xu, P. Y. Shi, H. Li, J. Zhou, Broad spectrum antiviral agent niclosamide and its therapeutic potential. ACS Infect. Dis. 6, 909–915 (2020).

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