选择最合适的二抗，不得不学的常识！

入门困惑

什么是二抗？

作为免疫学实验不可或缺的工具，二抗是指用于靶向结合一抗的抗体。在多种免疫印迹、ELISA以及免疫荧光等免疫实验中，二抗经常和一抗结合使用通过信号放大作用以检测目标蛋白。很多二抗都带有标记物，例如常见的Alexa Fluor荧光染料或辣根过氧化物酶（HRP），从而使二抗的信号可以被检测到。

专家建议

如何选择最合适的二抗？

要选择出一种最适用于您的应用和研究的最佳二抗，建议考虑以下因素：

● 种属来源和种属反应性

● 特异性反应

● 纯化方法

● 交叉吸附

● 多重检测能力

● 抗体类型和亚型

● 完整抗体还是抗体片段

● 标记物

● 生物素结合蛋白

需要详细了解关于选择二抗时需要考虑的因素，请阅读下文内容。

01

种属来源和种属反应性

种属（Host）来源是指制备这种二抗的物种。常见种属来源包括鸡、驴、山羊、小鼠、兔、大鼠以及绵羊。因大多数一抗是在小鼠或兔的体内制备的，山羊来源的抗鼠、抗兔IgG二抗是最广泛的商业化二抗。

注意：所用二抗的种属来源必须不同于一抗的种属来源和反应种属。例如，如果一抗来源于兔，则不能使用来源于兔的二抗。

02

特异性反应

区别于一抗的特异性概念（一抗只识别目标蛋白），二抗的特异性指针对一抗的反应特异性，其不仅包括特异识别目标物种（一般经交叉吸附），还包括特异识别目标免疫球蛋白（Ig）的类型或亚型，以及该二抗是否和抗体的特定部分结合。

常识：如果一抗使用兔多抗，则需要使用抗兔二抗。如果一抗是鼠IgG2b，则二抗需特异识别该亚型。

03

纯化方法

动物血清或腹水一般经四种常见纯化方法：亲和纯化、特异性纯化、层析法、脱盐法。大多数Invitrogen二抗经过亲和纯化（protein A或protein G），纯化后抗体纯度能达到95%以上。特异性纯化是将抗原固定后进行纯化的方法，可以保证抗体纯度和特异性更高，大多数Invitrogen流式应用的二抗都经过此方法纯化。

04

交叉吸附（Cross-Adsorbed）

对二抗进行交叉吸附可以帮助去除来源于非目标抗体和蛋白的交叉反应性，从而提高抗体的特异性。交叉吸附是指将亲和纯化的二抗通过一个固定有其它种属来源的抗体或血清蛋白的纯化柱。能够识别这些其它种属来源的抗体或血清蛋白的二抗将结合在纯化柱上，通过这种方法可以获得交叉反应性更低的二抗，从而降低背景和提升抗体效价。

如果想进一步避免交叉反应性，建议尝试Invitrogen抗体品名中注明“高度交叉吸附”Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody 的二抗或者Invitrogen™ Superclonal™重组二抗。

图1. 经交叉吸附处理的结果显示了极低的交叉反应性和背景信号。BPAE（牛肺动脉内皮）细胞使用Image-iT 固定/通透试剂盒（货号R37602），使用抗β-tubulin抗体标记，并使用交叉吸附处理的Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠二抗（货号A11029）和Click-iT EdU Alexa Fluor 647（货号C10340）二抗进行染色。

05

多重检测能力

多重检测是指使用不同的荧光染料同时检测多种目标蛋白。高度交叉吸附纯化的抗体降低了物种间交叉反应性和背景信号，可以很好的实现多重检测。选择标记物时需要注意选择发射光谱不重叠的标记物。

图2. Hela细胞中免疫荧光实验实现多重检测。 (A) 使用Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG二抗（货号A11034，绿色）检测一抗； (B) 使用DAPI进行核染色（蓝色）。 (C) 使用Alexa Fluor 594标记的鬼笔环肽对actin蛋白进行染色（红色），显示出visfatin蛋白的细胞质和细胞核定位的组合图。

06

抗体类型和亚型

抗体有几种不同的类型，每种类型在正常的免疫系统内都有特定的功能。我们目前提供针对人IgG、IgM、IgA、IgE和IgD的二抗。这些抗体都含有独特的重链，分别是γ、μ、α、ε和δ。IgG可进一步根据氨基酸组成的不同分为不同亚型——IgG1、IgG2等。

注意：选择特异性针对所用一抗类型或亚型的二抗。当使用的一抗是单克隆抗体时这一点尤为重要，因为根据定义，每种单克隆抗体仅属于一种抗体亚型。

07

完整抗体还是抗体片段

二抗分为完整抗体形式和抗体片段形式。使用完整抗体还是抗体片段通常取决于所进行的应用。例如，抗体片段对于免疫组织化学和免疫荧光是最佳选择，因为它们的分子量较小并易于穿透组织。在其它大多数应用中，完整抗体是最常用的二抗类型。

图3. 抗体片段的名称和结构

08

二抗对应的标记物

标记物的选择取决于所进行的应用以及如何检测二抗。选择之前先问自己几个问题：该实验需要高亮度和光稳定性的Alexa Fluor荧光染料进行细胞成像实验吗？需要使用高活性HRP标记物并通过化学发光底物进行灵敏的western blot检测吗？下面是对于我们提供的不同类型的荧光二抗标记物的介绍。

09

生物素结合蛋白

除了酶标二抗和荧光二抗以外，另外比较常用的还有biotin标记二抗，biotin标记二抗需要通过生物素结合蛋白才能实现信号放大，比如用酶标（HRP或AP）的亲和素（Avidin）和链霉亲和素（Streptavidin）与Biotin高强度结合。这样做的好处是：同一种检测试剂可以用于检测多种biotin标记抗体而无需考虑其宿主物种。

基于以上选择二抗要点

怎么才能精确找到对的抗体呢？

使用Invitrogen抗体的筛选工具（可登陆：www.thermofisher.com/antibodies），就能针对各参数快速筛选并找到最对的二抗。

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