当别人问你如何做出漂亮的Western Blot结果时。。。

作为最经典、最常用的实验技术之一，Western Blot可以说是实验生活的日常写照。这样一个耗时且涉及多个操作步骤的过程，有时带来惊喜，有时则是惊吓。

Western Blot三部曲——“电泳，转印，检测”——大家都很熟悉，原理很简单，但过程却不简单。毕竟蛋白之间的相互作用不可预测，又存在诸多外部影响因素，检测过程的每个环节都有可能影响数据质量。所以，想要尽可能提高结果的准确性与一致性，每个步骤都需精心优化和严谨操作。

思路决定出路，今天我们就来谈谈Western Blot的优化策略，希望能帮助你纵观全局，理清思路，将可能出现的问题扼杀于萌芽。

WB优化策略

● 蛋白定量

关键词：不可偷懒

在电泳之前对蛋白样品进行定量，确保上样总量相同，并且将上样量控制在合适范围。这样可以保证内参平齐，对比数据更有说服力；同时更容易保障不同次实验的一致性。

BCA法和Bradford法都是常用的蛋白定量技术，BCA法的优势在于线性范围宽，对去垢剂兼容性更好，均一性与蛋白间差异性更小，不过孵育时间较长（室温30分钟或更久）；Bradford法的优势在于反应时间短，但线性范围窄。如果希望兼顾速度与性能，推荐Thermo ScientificTM PierceTM Gold BCA快速蛋白定量试剂盒（货号A53225/A53226），室温孵育5分钟即可定量，同时保留经典BCA试剂盒的高性能。

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● 蛋白电泳

关键词：电泳成败直接影响显影结果

作为WB流程的重头戏，蛋白电泳通常是最耗时耗力的一环，也是最容易被大家忽略的一环。凝胶的品质与电泳条件是否优化，都决定着能否获得锐利笔直的条带。尤其是分析低丰度蛋白或磷酸化蛋白时，如何在上样与电泳过程中保存蛋白完整性，使其不会降解或修饰十分重要。

如果你希望解放双手，可以选择预制胶。需要留意的是，预制胶的优势不仅在于省时省力，更应体现在凝胶的高品质与实验结果的可重复性上。InvitrogenTM NuPAGETM Bis-Tris蛋白预制胶相较Tris-甘氨酸体系可更好地保存蛋白完整性，减少蛋白在电泳中的化学修饰，同时其严格的质控标准有助于提升结果重复性。即使无法使用预制胶，也需要选择高纯度的丙烯酰胺，考虑到丙烯酰胺在凝胶中占比较大，如果其杂质含量高，则很难得到漂亮的条带。

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● 蛋白转印

关键词：湿转和快转各有优劣

转印效率取决于诸多因素，如凝胶配方/厚度、印迹膜成分/孔径、凝胶与膜的接触是否充分、电极位置、转印持续时间、蛋白大小和上样组成、场强、缓冲体系以及是否存在去垢剂等。不同蛋白质的转印效率差异很大。因为在不同条件下，蛋白的凝胶迁移能力及其与膜结合能力存在差异。

传统的湿转在低离子强度缓冲液和低电流条件下进行，大多数蛋白质通常可实现理想的转印效果，但湿转动辄一两小时，还需要配一堆试剂；快速转印则需要高离子强度，在高电流条件下进行。随着快转技术的进步，其转印效率与数据线性度不断提升，即便是200-300kDa的大分子量蛋白，只要优化快转条件，照样能得到满意的结果。所以如果你想加快实验速度，省时省事，快速转印系统不失是一个好选择。

转印后可使用免疫印迹兼容型或可逆的染料进行膜染色，以评估转印效率。

传送门：湿转还是半干转？

● 封闭液

关键词：没有一种封闭液适合所有检测体系

由于蛋白之间的相互作用不可预测，在一个检测系统中效果良好的封闭液，可能会在另一个检测系统中导致高背景或信号降低，所以，当检测系统存在变量时（如改变靶点，抗体或底物），建议根据实验效果选择封闭液的类型，理想的封闭液可最大程度地提高信噪比，且不会与系统的抗体或靶点反应。Thermo Scientific StartingBlockTM 封闭液（货号37539/37543）配方不含血清与生物素、快速封闭、适用范围广、与多数抗体和生物素结合试剂相兼容，适合作为选择的起点，帮助简化优化操作。

一些体系可通过向封闭液中加入去垢剂达到更理想的效果，因为去垢剂可以更好地减少非特异性结合，从而最大程度地降低背景。通常，去垢剂的最终浓度为0.05%-0.1%；此外，使用高品质去垢剂会大大降低杂质（如过氧化物和醛酮类）对检测结果的影响。需要注意的是，并非所有系统均需要加入去垢剂进行优化；有时，加入过多的去垢剂也会对封闭效果造成影响。

小贴士：脱脂牛奶中含有磷酸化的酪蛋白，可能会增高磷酸化抗体检测时的背景信号，从而影响磷酸化蛋白的检测。

● 一抗的选择与浓度

关键词：一抗浓度不是越高越好

诚然流程中的每个变量都会影响数据质量，但抗体与抗原结合的亲和力和特异性确实至关重要，因此很多人认为决定WB成功的关键因素是一抗。此外，一抗的浓度也会在很大程度上影响信号的生成。如果一抗或二抗浓度过高，不但会因信号过强导致背景更高，信噪比更低的问题，你也会因此花费更多的银子却没有带来好的实验结果，通常降低一抗的浓度会有帮助，因为这会促进靶点特异性的结合并降低背景。

由于不同抗体间亲和力差异大，合适的浓度从几百到几万甚至几十万都有可能，当更换了抗体，或出现了非特异性条带/条带弥散/信号减弱等问题时，需要考虑优化抗体浓度。斑点印迹则是一个简单快速的方式，可以进行宽范围的稀释度检测。

您可将梯度稀释的抗原点在膜上（如使用SuperSignalTM底物检测，样品稀释在微克至飞克范围），依次进行封闭、一抗孵育、漂洗、二抗孵育、漂洗、底物孵育和成像检测。在浓度优化的体系中，底物产生的信号会稳定数小时。

另外，如果由于高背景或抗体结合力低导致WB实验效果不理想，还可以考虑使用信号增强剂进行预处理，以提高印迹的信噪比（图1）。

图1. SuperSignal信号增强剂（货号46640）可降低背景与增强特异性信号，实现低丰度蛋白的检测

小贴士：点膜时，每个点的体积越小越好（1-5μl），以保证点尽可能地小。如果需要使用5μl以上的样品，在点完一次后，干燥2-5分钟，再点一次。让膜干燥10-15分钟，或直至无可见水分。

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● 膜的漂洗

关键词：漂洗要充分

漂洗的重要性不容小觑，因为洗膜不充分容易产生高背景。在整个实验过程中，需确保所使用洗涤缓冲液的体积可完全覆盖印迹膜，避免膜变干，洗的同时可温和晃动。建议一抗孵育后漂洗至少3次，每次5分钟，酶标二抗孵育后漂洗至少5次，每次5分钟。如有非特异性背景，可尝试使用更大体积的漂洗缓冲液或增加漂洗次数和时间。如果仍未改善，则可能是其他步骤存在问题。

小贴士：始终避免手直接与膜接触，实验过程应戴手套或使用干净的镊子。所有设备必须清洁且不沾染外来物质。金属器械（如剪刀）不得有可见的锈迹，因为锈迹可能导致斑点和高背景。

● 二抗浓度

关键词：信号迅速淬灭的常见原因

在合适的底物类型、酶-底物比例以及其他各项因素都达到理想条件时，WB化学发光信号可持续数小时甚至24小时。免疫印迹体系中过多的酶标二抗是引起信号不稳定、高背景、信号持续时间短和灵敏度较低的首要原因。

平稳的信号发射曲线是理想的状态( 图2中信号2)，说明系统的各组分已经过优化，结果重复性好。信号迅速衰减则可能会导致偏差、低灵敏度以及信号无法采集。持久的信号可以最大程度地降低由转印效率、不同底物批次和其他因素引起的差异性。

图2. 信号发射曲线示例。当WB体系中存在过多酶时，加人底物后会迅速达到信号输出峰值，并迅速耗尽底物（信号1）。在理想系统中，信号发射强度会在加入底物约5分钟后达到峰值，并维持若干小时的平台期（信号2)。

小贴士：可通过使用不同浓度的二抗检测膜条，在第一次成像后，等待1-2小时后再次对膜条进行成像，来判断适合的二抗浓度。第二次成像时，如果该浓度仍可获得较强的信号，则此稀释度接近理想条件。

● 底物的选择

关键词：根据样本丰度或样品量搭配底物

市面上底物种类很多，如何挑出适合自己实验需求的那款呢？可从这3个角度来选择：

✦ 检测灵敏度。面对林林总总的“超敏”，“特敏”，“极敏”底物，建议通过查询说明书或根据实际使用效果来判断真正的灵敏度，以免精心选购的“超敏”底物实为普通级别。对于常规样本的检测，低皮克（pg）-高飞克（fg）级灵敏度的SuperSignal West Pico PLUS底物可以满足实验所需，可作为新靶点检测的首选。建议同时备一盒SuperSignal Femto超敏底物，其低飞克级灵敏度可轻松应对低丰度或稀有样本；

✦ 信号持续时间。发光信号越是持久，说明底物性能越稳定，检测体系的各组分也是优化的，这样可提高WB结果的重复性，更有助于实现长时间或者多次曝光；

✦ 性价比。除了考虑底物本身的成本，也需要考虑能否提供稳定的信号，在节约抗体与样本的情况下，通过更少的尝试、更顺利地获得理想结果。如果在这个环节大意了，导致最终检测的失败，那么损失的时间、样本和试剂成本会远高于底物。

传送门：不能将就的除了抗体，还有默默耕耘的底物

● 成像方法

关键词：当经典WB拥抱科技

传统方法是使用胶片捕获信号。胶片具有理想的灵敏度，无需昂贵的设备。但其局限性在于每张胶片只能使用一次，一般需要通过不同曝光时间尝试多次，才能掌握信号与背景之间的平衡，对操作技巧和经验要求较高。

好在CCD成像系统的出现带来了新的选择，其便捷性与性能优势已获得越来越多的认可。除了省掉暗室曝光的繁复操作，成像体验更为流畅和简单，CCD成像系统在动态范围和线性度上也已超越胶片。Invitrogen iBright CL1000和FL1000智能成像系统的智能曝光技术可以自动确定最佳曝光时间，避免曝光不足或过曝，即使是实验新手使用，也可轻松获取理想的印迹图像。FL1000更配备5个荧光通道，可同时进行4色荧光成像，在单块印迹上获取更多信息，为你的研究提供更详实的数据支持。

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