网络药理学专题 | IF14！中药代谢组+网络药理学研究牛樟芝治疗肝癌

牛樟芝通过在体外和体内靶向PI3K/AKT 介导的细胞周期进程发挥抗肝癌作用

●期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B

●IF：14.903

●发表时间：2021.7

肝细胞癌(HCC)被认为是最常见的肝癌亚型，是全球癌症相关死亡率的第四大原因，这不仅是由于其高扩散、转移和复发率，而且还由于治疗效果。目前，多种药物，如索拉非尼和瑞戈非尼，均能提高HCC患者的总体生存率。然而，这些药物存在一些问题，包括作用时间短、耐药性等问题。因此，寻找安全、高效、低毒、逆转耐药的新药迫在眉睫。

作为补充和替代医学的主流形式，中医药（TCM）因其有益的效果和没有严重的副作用而被癌症患者广泛接受。牛樟芝是一种稀有菌类，生长于中国台湾，分布于海拔200-2000 m的阔叶林中。药理研究表明，牛樟芝具有抗肿瘤、保肝、免疫调节、抑制血管新生内膜形成、降低血压和胆固醇、抑制血小板聚集等生理活性。在众多功能中保肝作用，尤其是抗HCC是最常报道的。牛樟菌可以降低HCC 细胞活力、增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡。然而，尚未阐明牛樟菌在抗 HCC中的主要作用和机制。

如今，牛樟芝以发酵酒或纯培养的粉末、片剂、滴丸和胶囊的形式在市场上销售，并逐渐成为台湾最受欢迎的保肝剂和保健品之一。最近的研究表明，牛樟芝含有多种生理活性化合物，包括萜类、腺苷、有机锗、微量元素、蛋白质、麦角甾醇、维生素、烟酸、核酸凝集素、甲壳素、木质素等。然而，目前有关牛樟芝化学指纹图谱的报道较为零散，缺乏系统研究。此外，对牛樟芝的研究主要集中在单个成分的治疗效果或定量分析上。从整体的角度来看，全面的化学指纹以及化学成分、分子靶点、信号通路和抗HCC 活性之间的相关性仍然难以捉摸。

通过代谢组学技术手段共鉴定到139个物质，包含102个萜类、8个苯环型、2个嘌呤核苷酸和22个其他类。

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图1 antcin A物质鉴定结果

对ACDPs中鉴定得到的成分利用SWISS ADME数据库筛选用于下一步的靶标预测分析的成分，筛选的成分必须满足两个条件：首先，胃肠道吸收（GI absortion）设置为“HIGH”作为药物吸收的条件，用于筛选具有良好口服生物利用度的活性化合物。其次，在五种预测性质（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中具有“YES”的两种或多种化合物可以被视为活性成分。其中有72种活性成分具有高胃肠道吸收和适当的药物相似性。

对满足筛选条件的成分使用Swiss TargetPrediction 用于预测化合物的靶标，筛选条件设定为可能性>0.12；同时，从NAPSS数据库中下载了关于ACDPs已验证目标的信息，与前面得到的靶标信息进行合并，并构建成分-靶标网络（图2A）。然后，对整合的目标进行GO和KEGG的富集分析（图2B、C）。GO富集分析表明，ACDPs的靶点与ERK1和ERK2级联的正调控，炎症反应、凋亡过程的负调控，细胞增殖的正调控等密切相关（图2B）。KEGG通路富集分析表明，ACDPs的靶点在癌症、乙型肝炎、FoxO信号通路、胰岛素抵抗等通路中显著富集（图2C）。

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图2 牛樟芝成分-靶点网络图及靶点GO/KEGG富集分析

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图3 肝癌靶点预测流程及结果

1.利用登录在GEO上的肝癌相关基因表达数据进行分析

在GSE14520、GSE45267、GSE64041和GSE112790的数据集中总共获得了514个HCC样本和341个正常样本。如图4A-D 所示，PCA的结果表明，每个样本中的肿瘤和正常组织样本数据集来自不同人群，说明样本来源可靠。然后，在ggplot2可视化后，limma包分析差异表达基因（DEGs）的热图如图4I-L所示。聚类热图结果证明，DEGs可以区分肿瘤组织和正常组织，因此DEGs可以代表整个样本。接着通过Robust Rank Aggreg (RRA)整合DEG，获得293个DEG，包括120个上调基因和173 个下调基因（图4M）。DKK1、REG3A、DEFB1、MMP12和LCN2是前五位上调基因，而STAB2、CLEC1B、CXCL14、FCN3和ASPM是前五位下调基因。

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图4 GEO获得的肝癌表达数据分析

(A)-(D) GSE14520、GSE45267、GSE64041和GSE112790的PCA图。 (E)-(H) GSE14520、GSE45267、GSE64041和GSE112790中DEG的火山图。(I)-(L) GSE14520、GSE45267、GSE64041和 GSE112790中DEG的热图。(M) TOP 20上调和下调DEG的热图。

2.利用GEO得到的差异表达基因，进一步在TCGA 数据库中继续筛选。

TCGA数据库中包含374个HCC组织和50个正常组织。生存分析表明，来自HCC患者的113个DEG与总生存率（期）显著相关。ROC分析显示，来自HCC患者的41个DEG与肿瘤的识别显著相关。在LIHC中，对总生存率（期）有显著影响的DEGs是AURKA、CCNB1、细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）、SUMO激活酶亚基1（SAE1）和拓扑异构酶IIα（TOP2A），这些基因的相应ROC曲线展示在图5。通过结合对总生存率（期）和肿瘤鉴定具有重要意义的LIHC结果，获得了与HCC密切相关的41个DEG（41个上调基因）。

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图5 靶标生存分析和ROC分析

3.DisGeNET数据库获取肝癌靶标

在DisGeNET数据库中有5725个与HCC相关的条目。通过将阈值设置为0.5，收集了40个HCC靶标。最后通过合并这些靶标，获得了79个HCC的靶标（生物标志物）。

将通过成分预测的靶点和疾病预测的靶点进行交叉分析，获得ACDPs中与HCC相关15个靶标（图6A）。然后将这些靶标使用STRING数据库和Cytoscape建立了蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。基于此，使用了MCODE计算PPI网络中具有特殊功能的模块的插件。筛选模块化分析得分≥4，共收集到CCNB1、CASP8、CCNE1、CDK1、PIK3CA、MET、AURKA、TOP2A和TERT等9个靶点。这些靶点的KEGG通路富集分析表明，它们显著富集了磷酸肌醇3激酶（PI3K）/AKT和细胞周期信号通路，例如癌症通路、病毒致癌通路和P53信号通路（图6B）。

同时，利用筛选得到的靶标与ACDP的活性成分建立成分-靶标网络图（图6C）。然后，使用分子对接方法来预测ACDP生物活性化合物与相应靶蛋白之间的相互作用。结果zhankuic acid E 与CDK1、PIK3CA和CCNE1具有潜在的高结合亲和力，灵芝醇B与CDK1和PIK3CA具有潜在的高结合亲和力，灵芝酚与CCNE1具有潜在的高结合亲和力，灵芝酚A具有与TERT的潜在高结合亲和力等等。活性化合物和蛋白质的三维和二维结合模式如图6D和E。综合起来，这些结果表明ACDPs可能通过降低细胞表达PI3K/AKT信号级联调节的循环相关蛋白而发挥抗肝癌作用。

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图6 成分-靶点-通路网络图构建及分子对接分析

1.体外实验

为了进一步验证ACDPs对HCC细胞的影响，利用体外培养人肝癌细胞系HepG2、Huh-7和SMMC-7721进行实验。

首先，使用细胞计数实验CCK-8测定法检查了ACDPs对细胞活力的影响。用不同浓度（0、0.4、0.8、1.6和3.2 mg/mL）的ACDP预处理细胞24或48小时。结果表明用ACDP处理细胞剂量和时间依赖性地抑制HCC细胞的活力（图7A-C）。然后，同时利用平板克隆形成实验进一步证明了ACDPs在体外具有合理的抗肝癌作用（图7D），与CCK-8测定的结果一致。此外，通过细胞增殖实验EdU 测定证实了ACDP的抗增殖作用（图7E-G）。

其次根据信息学结果，ACDPs可能通过调节PI3K/AKT通路影响细胞周期相关蛋白的表达。Western blot检测Huh-7细胞cyclin E1和CDK1的表达。如图7H所示，在ACDPs刺激后它们显著减少。除此之外还发现，在ACDPs刺激下，cleaved-caspase 8的表达增加。同时，ACDPs降低了PIK3CA的表达和AKT的活性。总之，ACDPs可以通过PI3K/AKT信号通路在肝癌中发挥抗癌作用。