2023-02-13 10:25:27 Merck工艺解决方案
2021年1月,国家药典委员会和食品药品国际交流中心出版《治疗用生物制品病毒风险控制要点》。在药典新增章节《生物制品病毒安全控制》的基础上,对生物制品病毒安全控制的指导法规、过程检查与控制策略给出了更详细的解释,具有指导实际操作的价值。
前期我们参与了《要点》部分章节的编写,并积极参与业内同行讨论。结合在病毒安全控制中的实践经验,我们陆续分享了几篇对《要点》的解读,希望能抛砖引玉,收获更多业内同行的真知灼见
实际工作中,我们常被问到:除了内源病毒,其他指示病毒应该如何计算?电镜检测不到病毒颗粒,该如何定量初始值?基因治疗产品如何评价病毒安全?等问题。在此,我们来先就“5.3.5每剂量病毒颗粒的估算”展开讨论。
其中,首要问题是:起始病毒颗粒数的定量方法。
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图1. 发酵液中类病毒颗粒数的电镜照片
以采用CHO细胞进行生物制品生产为例,评价培养料液(UPB)中病毒的起始量,是评估病毒安全性的“控制要点”。对于外源病毒的检测,无论是人源、猪源、牛源还是鼠源病毒,无论是in vivo、in vitro 还是特异性的PCR方法,都需要获得Negative的结论。
对于内源病毒而言,由于是CHO细胞天然携带内源性病毒的特征,通常会有Positive的定性结论,则需要通过电镜观察(图1)、逆转录酶活检测与感染性实验进行综合评估。其中,电镜观察法,一直是定量评价类病毒颗粒数的经典方法,被各国法规部门普遍接受,检测下限为~1x106 particles/ml,即6个log。
电镜计数的结果用于评价纯化工艺对于病毒清除能力。使用鼠白血病病毒(MuLV)作为指示病毒,来验证纯化工艺对内源病毒的清除能力。再结合纯化收率与设计剂量,可以计算出单一剂量的药物对应的病毒颗粒数。
如《要点》5.3.5示例中,单一剂量产品的病毒数为:<10-7.55particle/dose。ICH Q5A Appendix 5示例中,单一剂量产品的病毒数为:<10-6particle/dose。两个示例,都指出需要足够的病毒安全富裕量(Safety margin)。
在使用CHO细胞生产单抗的除病毒验证过程中,除代表内源病毒的小鼠白血病毒(MuLV),还常常选择伪狂犬病毒(PRV)、呼肠孤病毒III型(Reo-III)和鼠细小病毒(MMV),来代表其他潜在各种病毒类型,“DNA/RNA、有/无包膜、颗粒大小、尤其对物理/化学处理明显耐受的病毒等”。
如何定量评价这几种指示病毒的Safety margin 呢?首要问题是如何定量UPB中除内源以外其他病毒的初始Log值。
除了内源病毒可以用电镜定量初始的Log值,所有外源病毒的检测都需要获得Negative的结论。对外源病毒的检测,通常需要将UPB样品与指示细胞共培养28天,通过对指示细胞的形态观察、血吸附实验或荧光抗体检测来判断检测终点。
虽然验证得到的检测下限一般为10×TCID50,但这种检查终点是指示细胞培养放大后的结果,无法对应到UPB的病毒颗粒log数。有业内同行用log1=0,作为非内源指示病毒的初始数量,以6~8个log作为总清除能力的目标,这也只是一种经验性判断。
CH Q5A Appendix 5与《要点》示例的计算方法,都适用于计算检测内源病毒所需的初始颗粒数。如何对其他非内源病毒的Safety margin进行计算,我们就一种定量UPB病毒初始含量的思路进行讨论。
问题又来了,Negative 的结论如何进行定量呢?这里分享我们的一种思路,可以参考电镜检查的Negative检测的处理方式。如果通过电镜检查,没有观察到类病毒颗粒,那就按照该方法的检测下限进行定量。
默克BioReliance®电镜方法检测下限为1.4x105 particles/ml,在没有检查病毒颗粒的情况下,计初始log值为6。
2020版《中国药典》,新增加了针对外源性鼠源性病毒3303的“荧光定量PCR法”,结合《药典》要求CHO细胞系需检查的MMV,我们整理了所需检测的八种病毒特征,汇总见附录表1,常用模型病毒的特征见附录表2。
默克BioReliance®针对CHO内源病毒Type C的qPCR(CHOp)的计量下限是1x103 particles/ml,也就是Negative 的结论对应于初始Log值为3,相比电镜检查的Negative 的定量水平更低。
如何将qPCR的检测下限,例如对Type C的检测下限20 copies/reaction 转变为log值,见以下的计算公式:
针对Type C类病毒颗粒的qPCR检测中,CHOp方法的检测下限为20 copies/reaction,提取的样品体积为130μL,洗脱体积为65μL,反应体积为5μL,每个Type C颗粒包含copy数为2。计算得出1000 particle/ml, Log值为3。
以qPCR检测鼠细小病毒MMV为例,用于检测UPB中MMV的qPCR方法,如检测下限为10 copies/reaction,提取的样品体积为280μL,洗脱体积为200μL,反应体积为5μL,每个MMV包含copy数为1。计算得出MMV的检测下限1429 particles/ml,log值为3.15。当检测结果为Negative,可以以3.15为起始病毒颗粒数log值,用来评估下游工艺的除病毒能力。
相对于MuLV ≥6个log初始值,3.15个log的MMV,并不会额外增加下游纯化的压力。
按照这种定量思路,可以拓展ICH Q5A Appendix 5与《要点》示例的计算方法,针对非内源病毒,“DNA/RNA、有/无包膜、颗粒大小、尤其对物理/化学处理明显耐受的病毒等”,都可以基于PCR方法Negative的检测结论,计算纯化工艺可以提供的Safety margin。
相比之前对非内源病毒Safety margin的评估,只能参考对MuLV清除能力,或参考经验值6~8log,基于qPCR的检测结论进行计算,其依据更为充分。
因此,默克BioReliance® Blazar™推出的PCR检测平台已经可以覆盖《中国药典》中示例的外源性病毒,并完全覆盖了ICH Q5所列出的MAP、HAP与RAP的目标病毒。
当生产细胞不产生内源病毒颗粒,如生产基因治疗载体的细胞系,也可以如法炮制,以qPCR方法对病毒的检测为基础,评价病毒安全的风险和纯化工艺带来的“safety margin”。
本篇解读,完全是基于技术问题的讨论,是对PCR技术应用的介绍,并不代表官方指导标准。希望能抛砖引玉,收获更多业内同行的真知灼见。
附录表1. 《药典》3303推荐采用PCR检测的8种病毒与MMV
附录表2. 针对CHO生物制品的模型病毒
编者简介
高飞 博士
2009年毕业于中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室。现任默克BioReliance®检测服务高级技术专家,为大中华区客户提供专业的技术法规咨询和项目实施方案。高飞博士拥有10年以上的专业经验,曾任知名外企下游团队经理,中国科学院过程工程研究所,副研究员。
默克BioReliance®检测服务
默克BioReliance®测试服务是生物制药行业委托服务的领先提供商,为生物药物开发和生产全过程提供合规化质量检测服务。经过70多年的方法学储备和密切法规合作,我们协同遍及全球的四大服务中心,竭诚为您提供适用与生物药物的去病毒验证服务,生物安全测试服务,生物大分子产品表征分析,细胞及基因治疗产品检测,毒理学分析,以及法规技术咨询服务。
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关于默克工艺解决方案
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