2023-02-09 17:35:34, 赛默飞生命科学 赛默飞世尔科技生命科学产品
2020年,新冠病毒的爆发引起了全国的核酸检测潮,让广大人民群众知道了什么是“核酸”。KingFisher系列核酸提取仪为争分夺秒的大筛查立下了汗马功劳。
其实KingFisher仪器是多功能的磁珠纯化系统,不只用于核酸提取,还能应用于蛋白&抗体纯化、细胞富集&分选、宿主细胞核酸残留检测、核酸适配体筛选、噬菌体表面展示等各领域。
下面小赛给大家分享一篇关于免疫磁珠法富集浓缩血液样品中稀有肿瘤细胞的文章,来看下KingFisher家族这不为人所熟知的一面。
这是一篇于2020年发表在Cancers的文章。在文章中,作者对比了两个基于磁珠法的系统:IsoFlux系统(目前市面上唯一可用的半自动磁珠免疫磁性系统,Fluxion Biosciences Inc., Alameda, CA, USA)和 KingFisher Duo Prime自动磁珠纯化系统(ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA),用于浓缩血液样品中稀有肿瘤细胞的富集和检测。
以往报道表明,1mL血液中通常只有1-10个CTCs(circulating tumor cells 循环肿瘤细胞),标准血液样本(7.5-10mL)的低血量是导致检测频率低的主要原因,而DLA(diagnostic leukapheresis,诊断性白细胞分离法)可显着改善检测到的CTCs的频率和数量。DLA基于外周血液的连续流动离心,使基于密度的细胞组分分离,从而有选择性的收集这些细胞,而应用DLA来富集CTCs就是由于CTCs与外周血单核细胞(PBMNCs)具有相似的密度,可以与患者的PBMNCs一起采集。
实验目的
测试比较IsoFlux和KingFisher Duo Prime系统对于从浓缩血液样本中分离富集稀有肿瘤细胞的效率。
IsoFlux系统已被证明对基于EpCAM(表达上皮细胞黏附分子,常见于CTCs免疫磁性富集检测)的乳腺、前列腺和结直肠细胞以及前列腺癌、肝细胞癌和膀胱癌患者的CTCs的富集是有效的。KingFisher Duo Prime纯化系统则从未报道过用于分离稀有细胞。
实验信息
➢样本:将来自三个胰腺癌细胞系(CAPAN-1、MIAPACA-2和Hup-T4)的一定数量的细胞(即CTCs)添加到1mL 10⁸个PBMNCs中,模拟DLA的样本
➢方法:免疫磁性富集,回收添加到模拟DLA中的CTCs
➢仪器:IsoFlux和KingFisher Duo Prime
➢磁珠:Fluxion Biosciences三种试剂盒(含磁珠),ThermoFisher Scientific三种Dynabeads磁珠和一种Pierce磁珠
➢肿瘤细胞表面标记物:将磁珠与不同的抗EpCAM和抗MUC-1(粘蛋白1,一种跨膜糖蛋白,在大多数胰腺肿瘤中高度表达)抗体偶联
➢检测方式:回收的细胞用荧光显微镜计数和记录
实验1
检测抗原决定簇在模型细胞系中的表达水平
为了分析模型细胞对富集实验的适用性,作者研究了三种不同的人胰腺癌细胞株表面的两种抗原决定簇EpCAM和MUC-1表达水平。
根据检测到的表位水平,归类为以下结果:
➤ Hup-T4:EpCAMHigh/MUC-1Low,
➤ CAPAN-1:EpCAMMid/MUC-1High,
➤ MIAPACA-2:EpCAMLow/MUC-1Neg。
在三种细胞株中都能检测到EpCAM表达,只有在CAPAN-1细胞上才能检测到清晰的MUC-1表达(图1A)。抗EpCAM中VU1D9克隆比BerEP4克隆能检测到更多的表位,抗MUC-1的两个克隆检测到的表位数目没有太大差别(图1B)。
图1. MUC-1和EpCAM在Hup-T4、CAPAN-1和MIAPACA-2胰腺细胞系中的表达。(A)免疫荧光显微镜分析EpCAM和MUC-1的表达。(B)两个抗MUC-1克隆(EMA201和GP1.4)和两个抗EpCAM克隆(VU1D9和Ber-Ep4)通过流式细胞仪检测到的表位数目。
实验2
测试7种磁珠
对于IsoFlux系统,作者使用了三种不同类型的磁珠(Iso-CEK、IsoRCEK和Iso-RCEK-SA),并根据说明书进行浓缩(表1)。对于KingFisher系统,作者测试了ThermoFisher Scientific的四种不同类型的磁珠(Dy-EPE、Dy-ACK、Dy-Biob和Pi-Strep),并测试了三种不同数量的磁珠(最小MIN、中间MID和最大MAX,见表1)。
表1. 在IsoFlux系统和KingFisher系统上用于富集的磁珠
这些不同数量的磁珠在明场显微镜下清晰可见(图2A),但它们并不影响荧光标记细胞的识别,即使在载玻片上磁珠浓度最高的区域(通常是样本场的中心)也是如此(图2B)。
图2. 对于磁珠中富集细胞的荧光标记鉴定。(A)Iso-CEK,Iso-RCEK, Dy-EpEMIN,MID,MAX 和Dy-BioBMIN,MID,MAX 磁珠的显微镜明场图像,(B)Dy-EpE磁珠富集的一个样本中的6个独立细胞。
实验3
基于表面抗原EpCAM富集CTCs
IsoFlux使用其标准程序,作者为KingFisher Duo Prime系统设计了具有一次细胞富集和一次细胞洗涤步骤的程序。
对于所使用的每种磁珠,回收效率与细胞中EpCAM的表达水平总体上是一致的:Hup-T4细胞>CAPAN-1细胞>MIAPACA-2细胞(图3)。
图3. 基于EpCAM回收模拟DLA产物中的HuP-T4、CAPAN-1和MIA-PACA-2细胞。使用IsoFlux系统和三种磁珠(Iso-CEK, Iso-RCEK, Iso-RCIK-SA)(上),KingFisher系统和4种磁珠(Dy-EpE, Dy-ACK, Dy-BioB, Pi-Strep) 的三种不同数量(下)从3种细胞系中回收50个预标记细胞。
Hup-T4细胞的回收率(43%-78%)总体上比CAPAN-1细胞(34%-52%)更高;KingFisher搭配Dynabeads均获得了更高的回收率(图4)。
图4. 在IsoFlux系统中使用Iso-CEK和Iso-RECK-BerEP4磁珠,在KingFisher系统中使用Dy-EpEMID和Dy-BioBMAX-VU1D9磁珠回收不同数量的预标记的Hup - T4和CAPAN-1细胞。
有趣的是,KingFisher搭配Dy-BioBMAX-VU1D9磁珠,还可以回收HCT-116、SW620(都是结直肠癌)和SKBR-3(乳腺癌)细胞,表明该系统也可以应用于其他实体肿瘤(图5)。
图5. 在KingFisher系统中使用Dy-BioBMAX-VU1D9磁珠富集HCT-116、SW620和SKBR-3细胞的回收率。
实验4
利用KingFisher系统富集CTCs的其他可行性方案测试
对于胰腺导管腺癌这样的肿瘤, EpCAM的表达水平特别不均匀,大约50%的病例中表达水平较低,这可能解释了基于EpCAM的检测方法检测到的CTCs数量和频率相对较低的原因。为了克服使用EpCAM作为单一表位富集CTCs的局限性,作者同时选用了另一个表面蛋白——MUC-1进行了富集胰腺肿瘤细胞的实验。
使用 Dy-BioBMAX 和 Iso-RCEK 磁珠在各自的系统中测试了表面蛋白MUC-1作为富集胰腺细胞的另一种策略,仅基于MUC-1的回收率比使用相同的磁珠基于EpCAM的回收率要低得多,将MUC-1和EpCAM偶联的磁珠在同一富集步骤(同时富集),只能部分提高回收率(图6A)。
而利用KingFisher回收50个预先标记的CAPAN-1细胞,基于MUC-1和基于EpCAM的磁珠先后富集,可得到与基于EpCAM的单独富集相似的结果(图6A),并实现同时捕获两个独立的细胞群体(图6B)。
图6. 单独MUC-1和MUC-1 /EpCAM联合回收在模拟DLA产物中添加的CAPAN-1细胞。(A)(左)在IsoFlux系统上,单独使用抗MUC-1克隆偶联Iso-RCEK磁珠或和抗EpCAM偶联磁珠联合使用(同时富集),50个预标记CAPAN-1细胞的回收率;(右)在KingFisher系统上,单独使用Dy-BioB偶联GP1.4克隆磁珠或和Dy-BioB抗EpCAM偶联磁珠联合使用(同时和先后富集),50个预标记CAPAN-1细胞的回收率。(B)在KingFisher系统上,基于EpCAM和MUC-1连续富集后,50个预标记CAPAN-1细胞的回收率。
实验5
研究染色对富集细胞的影响
测试细胞染色过程对富集后临床样本中CTCs计数的影响,对50个预先标记的CAPAN-1细胞进行回收,结果如下(图7A):IsoFlux——使用对应的细胞计数试剂盒(手工),染色后细胞回收率减少了52%(46%→22%),KingFisher——使用自动化程序,染色后回收率减少了24% (68% → 52%)。KingFisher自动化染色后细胞损失更少。
值得注意的是,当有效地进行基于抗体的染色时,可以观察到Iso-CEK、Iso-RCEK、Dy-EpE磁珠本身的荧光强度增加(尤其是CD45-AF647通道),表明这些磁珠有非特异性捕获染色抗体的能力。只有Dy-BioB正常,这是因为与Dy-BioB偶联依赖于生物素,而染色抗体中并不存在生物素。(图7B)
图7. 染色对模拟DLA产物中添加细胞的回收和鉴定的影响。(A)染色过程的影响。(上)使用Iso-CEK磁珠恢复50个预先标记的CAPAN-1细胞,并按照IsoFlux方案进行后续染色程序,或不进行后续染色程序。(下)使用Dy-BioBMAX磁珠回收50个预先标记的CAPAN-1细胞,使用KingFisher系统自动进行后续染色程序。(B)磁珠在免疫荧光识别中的影响。以Iso-CEK、Iso-RCEK、Dy-EpE和Dy-BioB磁珠富集的细胞用DAPI、CK-AF488、CD45-AF647小鼠单克隆抗体染色。
总结01
根据已有的报道和本文结果,IsoFlux和KingFisher是唯二可用于半自动磁珠法富集循环肿瘤细胞CTCs的系统;
02
IsoFlux系统可同时处理4个样本,而KingFisher Duo Prime能同时处理12个样本,使用KingFisher Flex或Apex则可拓展至同时处理96个样本,且KingFisher系统可以实现细胞富集后自动化染色,染色后细胞损失更少;
03
在IsoFlux系统中,由于样品只经历一次磁吸,细胞只有一次(非常短的)机会被采集,而在KingFisher中共磁吸7.5min,这段较长的时间将有利于细胞回收;
04
KingFisher系统可对每一步操作进行自定义调整,磁珠类型更丰富(可单独采购不同的Dynabeads),磁珠绑定不同抗体可实现不同稀有细胞的富集——程序可调,磁珠可选,表面基团可挑;
05
使用KingFisher系统连续捕获EpCAM和MUC-1可能会增加CTCs的产量,并允许捕获不同的CTCs亚群,可应用于不同肿瘤实体;
06
浓缩血液样本中稀有细胞的免疫磁性回收是由多种因素(如细胞大小、磁珠大小、表位表达、样本固定、抗体亲和力和磁场)决定的,虽然这两个系统都可以富集稀有细胞,但从总体来看,KingFisher系统的细胞回收效率更高。
参考文献:
Junhao Wu, Katharina Raba, Rosa Guglielmi, et al. Magnetic-Based Enrichment of Rare Cells from High Concentrated Blood Samples. Cancers 2020, 12(4), 933
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