文献分享：KingFisher的细胞纯化之旅

这是一篇于2020年发表在Cancers的文章。在文章中，作者对比了两个基于磁珠法的系统：IsoFlux系统（目前市面上唯一可用的半自动磁珠免疫磁性系统，Fluxion Biosciences Inc., Alameda, CA, USA）和 KingFisher Duo Prime自动磁珠纯化系统（ThermoFisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA），用于浓缩血液样品中稀有肿瘤细胞的富集和检测。

以往报道表明，1mL血液中通常只有1-10个CTCs（circulating tumor cells 循环肿瘤细胞），标准血液样本（7.5-10mL）的低血量是导致检测频率低的主要原因，而DLA（diagnostic leukapheresis，诊断性白细胞分离法）可显着改善检测到的CTCs的频率和数量。DLA基于外周血液的连续流动离心，使基于密度的细胞组分分离，从而有选择性的收集这些细胞，而应用DLA来富集CTCs就是由于CTCs与外周血单核细胞（PBMNCs）具有相似的密度，可以与患者的PBMNCs一起采集。

测试比较IsoFlux和KingFisher Duo Prime系统对于从浓缩血液样本中分离富集稀有肿瘤细胞的效率。

IsoFlux系统已被证明对基于EpCAM（表达上皮细胞黏附分子，常见于CTCs免疫磁性富集检测）的乳腺、前列腺和结直肠细胞以及前列腺癌、肝细胞癌和膀胱癌患者的CTCs的富集是有效的。KingFisher Duo Prime纯化系统则从未报道过用于分离稀有细胞。

➢样本：将来自三个胰腺癌细胞系（CAPAN-1、MIAPACA-2和Hup-T4）的一定数量的细胞（即CTCs）添加到1mL 10⁸个PBMNCs中，模拟DLA的样本

➢方法：免疫磁性富集，回收添加到模拟DLA中的CTCs

➢仪器：IsoFlux和KingFisher Duo Prime

➢磁珠：Fluxion Biosciences三种试剂盒（含磁珠），ThermoFisher Scientific三种Dynabeads磁珠和一种Pierce磁珠

➢肿瘤细胞表面标记物：将磁珠与不同的抗EpCAM和抗MUC-1（粘蛋白1，一种跨膜糖蛋白，在大多数胰腺肿瘤中高度表达）抗体偶联

➢检测方式：回收的细胞用荧光显微镜计数和记录

为了分析模型细胞对富集实验的适用性，作者研究了三种不同的人胰腺癌细胞株表面的两种抗原决定簇EpCAM和MUC-1表达水平。

根据检测到的表位水平，归类为以下结果：

➤ Hup-T4：EpCAM^High/MUC-1^Low，

➤ CAPAN-1：EpCAM^Mid/MUC-1^High，

➤ MIAPACA-2：EpCAM^Low/MUC-1^Neg。

在三种细胞株中都能检测到EpCAM表达，只有在CAPAN-1细胞上才能检测到清晰的MUC-1表达（图1A）。抗EpCAM中VU1D9克隆比BerEP4克隆能检测到更多的表位，抗MUC-1的两个克隆检测到的表位数目没有太大差别（图1B）。

图1. MUC-1和EpCAM在Hup-T4、CAPAN-1和MIAPACA-2胰腺细胞系中的表达。（A）免疫荧光显微镜分析EpCAM和MUC-1的表达。（B）两个抗MUC-1克隆（EMA201和GP1.4）和两个抗EpCAM克隆（VU1D9和Ber-Ep4）通过流式细胞仪检测到的表位数目。

对于IsoFlux系统，作者使用了三种不同类型的磁珠（Iso-CEK、IsoRCEK和Iso-RCEK-SA），并根据说明书进行浓缩（表1）。对于KingFisher系统，作者测试了ThermoFisher Scientific的四种不同类型的磁珠（Dy-EPE、Dy-ACK、Dy-Biob和Pi-Strep），并测试了三种不同数量的磁珠（最小MIN、中间MID和最大MAX，见表1）。

表1. 在IsoFlux系统和KingFisher系统上用于富集的磁珠

这些不同数量的磁珠在明场显微镜下清晰可见（图2A），但它们并不影响荧光标记细胞的识别，即使在载玻片上磁珠浓度最高的区域（通常是样本场的中心）也是如此（图2B）。

图2. 对于磁珠中富集细胞的荧光标记鉴定。（A）Iso-CEK,Iso-RCEK, Dy-EpE^MIN,MID,MAX 和Dy-BioB^MIN,MID,MAX 磁珠的显微镜明场图像，（B）Dy-EpE磁珠富集的一个样本中的6个独立细胞。

IsoFlux使用其标准程序，作者为KingFisher Duo Prime系统设计了具有一次细胞富集和一次细胞洗涤步骤的程序。

对于所使用的每种磁珠，回收效率与细胞中EpCAM的表达水平总体上是一致的：Hup-T4细胞>CAPAN-1细胞>MIAPACA-2细胞（图3）。

图3. 基于EpCAM回收模拟DLA产物中的HuP-T4、CAPAN-1和MIA-PACA-2细胞。使用IsoFlux系统和三种磁珠（Iso-CEK, Iso-RCEK, Iso-RCIK-SA)（上），KingFisher系统和4种磁珠(Dy-EpE, Dy-ACK, Dy-BioB, Pi-Strep) 的三种不同数量（下）从3种细胞系中回收50个预标记细胞。

Hup-T4细胞的回收率（43%-78%）总体上比CAPAN-1细胞（34%-52%）更高；KingFisher搭配Dynabeads均获得了更高的回收率（图4）。

图4. 在IsoFlux系统中使用Iso-CEK和Iso-RECK-BerEP4磁珠，在KingFisher系统中使用Dy-EpE^MID和Dy-BioB^MAX-VU1D9磁珠回收不同数量的预标记的Hup - T4和CAPAN-1细胞。

有趣的是，KingFisher搭配Dy-BioBMAX-VU1D9磁珠，还可以回收HCT-116、SW620（都是结直肠癌）和SKBR-3（乳腺癌）细胞，表明该系统也可以应用于其他实体肿瘤（图5）。

图5. 在KingFisher系统中使用Dy-BioB^MAX-VU1D9磁珠富集HCT-116、SW620和SKBR-3细胞的回收率。

对于胰腺导管腺癌这样的肿瘤， EpCAM的表达水平特别不均匀，大约50%的病例中表达水平较低，这可能解释了基于EpCAM的检测方法检测到的CTCs数量和频率相对较低的原因。为了克服使用EpCAM作为单一表位富集CTCs的局限性，作者同时选用了另一个表面蛋白——MUC-1进行了富集胰腺肿瘤细胞的实验。

使用 Dy-BioBMAX 和 Iso-RCEK 磁珠在各自的系统中测试了表面蛋白MUC-1作为富集胰腺细胞的另一种策略，仅基于MUC-1的回收率比使用相同的磁珠基于EpCAM的回收率要低得多，将MUC-1和EpCAM偶联的磁珠在同一富集步骤（同时富集），只能部分提高回收率（图6A）。

而利用KingFisher回收50个预先标记的CAPAN-1细胞，基于MUC-1和基于EpCAM的磁珠先后富集，可得到与基于EpCAM的单独富集相似的结果（图6A），并实现同时捕获两个独立的细胞群体（图6B）。

图6. 单独MUC-1和MUC-1 /EpCAM联合回收在模拟DLA产物中添加的CAPAN-1细胞。（A）（左）在IsoFlux系统上，单独使用抗MUC-1克隆偶联Iso-RCEK磁珠或和抗EpCAM偶联磁珠联合使用（同时富集），50个预标记CAPAN-1细胞的回收率；（右）在KingFisher系统上，单独使用Dy-BioB偶联GP1.4克隆磁珠或和Dy-BioB抗EpCAM偶联磁珠联合使用（同时和先后富集），50个预标记CAPAN-1细胞的回收率。（B）在KingFisher系统上，基于EpCAM和MUC-1连续富集后，50个预标记CAPAN-1细胞的回收率。

测试细胞染色过程对富集后临床样本中CTCs计数的影响，对50个预先标记的CAPAN-1细胞进行回收，结果如下（图7A）：IsoFlux——使用对应的细胞计数试剂盒（手工），染色后细胞回收率减少了52%（46%→22%），KingFisher——使用自动化程序，染色后回收率减少了24% （68% → 52%）。KingFisher自动化染色后细胞损失更少。

值得注意的是，当有效地进行基于抗体的染色时，可以观察到Iso-CEK、Iso-RCEK、Dy-EpE磁珠本身的荧光强度增加（尤其是CD45-AF647通道），表明这些磁珠有非特异性捕获染色抗体的能力。只有Dy-BioB正常，这是因为与Dy-BioB偶联依赖于生物素，而染色抗体中并不存在生物素。（图7B）

图7. 染色对模拟DLA产物中添加细胞的回收和鉴定的影响。（A）染色过程的影响。(上)使用Iso-CEK磁珠恢复50个预先标记的CAPAN-1细胞，并按照IsoFlux方案进行后续染色程序，或不进行后续染色程序。(下)使用Dy-BioB^MAX磁珠回收50个预先标记的CAPAN-1细胞，使用KingFisher系统自动进行后续染色程序。（B）磁珠在免疫荧光识别中的影响。以Iso-CEK、Iso-RCEK、Dy-EpE和Dy-BioB磁珠富集的细胞用DAPI、CK-AF488、CD45-AF647小鼠单克隆抗体染色。

参考文献：

Junhao Wu, Katharina Raba, Rosa Guglielmi, et al. Magnetic-Based Enrichment of Rare Cells from High Concentrated Blood Samples. Cancers 2020, 12(4), 933

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